[发明专利]检测I型牛疱疹病毒的引物对、探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种检测I型牛疱疹病毒的引物对、探针、试剂盒及方法。

背景技术

I型牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus 1,BHV-1)，又称传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)，主要引起牛急性热性接触性传染造成传染性坏死性鼻炎(即“红鼻病”)。该病可导致机体细胞免疫功能降低和免疫抑制，易引起继发感染，主要通过空气、媒介物或者与病牛直接接触而传播，传染性强，对产奶、繁育及使役均有较大影响。

牛疱疹病毒感染在世界范围内广泛存在，尤其在养牛业比较发达的地区，在养殖规模不断扩大的情况下，流行趋势愈发严重。BHV-1侵入牛体后，以潜伏感染和持续性感染为主要特点，病牛可终生带毒。该病目前缺乏特效药物，病牛死亡率较高，给养殖业造成巨大的经济损失。近年来，受国外牛疱疹病毒感染广泛流行的影响，我国从国外引进种牛后，各地陆续报道了BHV-1抗体阳性牛检出的情况。鉴于此病危害较为严重，且分布较广，因而，对该病的发生与流行情况进行普查工作显得十分必要。

因为BHV-1可导致持续性感染，免疫并不能有效阻止野毒入侵和繁殖，防治本病的关键措施是对牛群进行定期检疫，控制传染源。目前发现BHV-1的基因包括gC、gE等非病毒复制所必需的基因，因此，这些基因成为了构建缺失疫苗的缺失对象。国外很早就已开始应用包括gE缺失的单基因缺失苗、双基因缺失苗以及三基因缺失苗于生产实践，其中gE基因缺失苗免疫可以在早期产生免疫应答，在爆发的早期使用可以有效的预防病毒的流行。但是基因缺失疫苗的使用，迫切需要高灵敏度、高通量的检测方法与之配套。现有的检测方法有血清中和试验(SN)、琼脂扩散试验、间接血凝试验、ELISA以及核酸探针检测等，但这些方法存在特异性不强、灵敏度差、耗时长等缺点，且都不适用于检测使用了gE缺失弱毒疫苗的感染牛群。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测I型牛疱疹病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，该试剂盒及方法能快速、准确、灵敏、特异地对BHV-1病毒进行检测，并能有效鉴别BHV-1野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种检测I型牛疱疹病毒的引物对，所述引物对是针对I型牛疱疹病毒Cooper毒株gE基因序列第1607-1704位如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列设计的引物对。

优选的，所述引物对具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测I型牛疱疹病毒的探针，所述探针是针对I型牛疱疹病毒Cooper毒株gE基因序列第1607-1704位如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列设计的探针。

优选的，所述探针具有如SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测I型牛疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对和探针。

优选的，所述试剂盒还包括：含有I型牛疱疹病毒Cooper毒株gE基因序列第1607-1704位如SEQ ID No:4所示核苷酸序列的阳性重组质粒标准品。

在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备快速鉴定I型牛疱疹病毒的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测I型牛疱疹病毒的方法，包括以下步骤：采集牛鼻腔棉拭子液或阴道分泌物，提取I型牛疱疹病毒的DNA为模板，利用上述的引物对和探针，进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。

在本发明的另一方面，还提供了一种鉴别I型牛疱疹病毒野毒株和I型牛疱疹病毒gE基因缺失疫苗株的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对和探针。

在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备区分I型牛疱疹病毒野毒株和I型牛疱疹病毒gE基因缺失疫苗株的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过设计出特异性的引物对和探针，优化荧光定量PCR检测方法的反应条件，从而快速、准确、特异性地针对I型牛疱疹病毒(BHV-1)进行检测，不仅可以实现对牛只的大样本筛查，而且能有效鉴别BHV-1野毒株感染牛只和gE基因缺失疫苗株免疫牛只；

2、本发明的荧光定量PCR检测试剂盒，只需收集能提取到微量cDNA的牛鼻腔棉拭子液或阴道分泌物，就可采用合成的引物对和探针进行方便快捷的检测，便捷廉价；