[发明专利]一种烟酰胺的生产工艺

权利要求书

1.一种烟酰胺的生产工艺，包括：重组腈水合酶基因工程菌的构建，所述工程菌的发酵培养以及利用所述工程菌催化3-氰基吡啶得到烟酰胺；其特征在于：

所述重组腈水合酶基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述宿主细胞为大肠杆菌，所述目的基因为碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的腈水合酶基因；

所述发酵培养的过程包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵；

所述补料分批发酵的过程包括：

（1）细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为32~35℃，发酵液的溶氧量为20~30%，发酵液的pH值为6.8~7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2~0.5之间；以基础发酵培养基的体积计，所述基因工程菌菌种的接种量为5~15%；发酵培养的时间为8~16 h；

（2）产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD₆₀₀=70~90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为18~20℃，发酵液的溶氧量为30~50%，发酵液的pH值为6.8~7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01~0.1之间；以发酵液的体积计，所述乳糖的投加量为5~15g/L；发酵培养的时间为48~96 h；

所述基础发酵培养基为：20 g/L甘油，8 g/L蛋白胨，12 g/L酵母抽提物，17.1 g/LNa₂HPO₄·12 H₂O，3.0 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH₄Cl和0.6 g/L MgSO₄，卡那霉素浓度为50 µg/mL；

所述补料培养基为：300~600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物；

所述催化的过程包括：（A）以水为溶剂，重悬所述工程菌，制得细胞悬液；（B）向所述细胞悬液中分批加入底物3-氰基吡啶，控制反应体系中3-氰基吡啶的浓度≤90g/L，进行水合反应，得到产物烟酰胺。

2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。

3.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述菌种活化的过程，包括：将基因工程菌菌株接种至固体培养基上进行活化培养；

所述活化培养的温度为35~37℃，时间为8~16h；所述固体培养基为：LB-Kan固体培养基，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化钠，pH 7.0，20g/L琼脂粉，卡那霉素浓度为50 µg/mL。

4.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述种子培养的过程，包括：将活化后的菌种接种至一级种子培养基中，进行一级培养；再接种至二级种子培养基中进行二级培养；所述一级培养的温度为35~37℃，时间为8~24h；所述二级培养的温度为35~37℃，时间为3~12h；所述一级种子培养基为LB培养基，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化钠，pH 7.0，卡那霉素浓度为50 µg/mL；所述二级种子培养基为12 g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43 g/L K₂HPO₄·3 H₂O，2.31 g/L KH₂PO₄，5.04 g/L甘油，卡那霉素浓度为50 µg/mL。

5.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，以腈水合酶酶活计，所述细胞悬液中重组腈水合酶基因工程菌的添加量为5 ~10万U/L。

6.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述水合反应的温度为15~25℃；反应体系的pH值为6.5~8.5。

7.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤（B）中，分批加入的次数为4~8次。