[发明专利]一种重组高温镍铁氢化酶的异源表达纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种高温镍铁氢化酶异源表达方法，其步骤包括：

(1)将来源于Pyrococcus furiosus的高温镍铁氢化酶编码基因插入穿梭表达载体；

(2)将步骤(1)获得的穿梭表达载体转化Thermococcus kodakarensis并表达；

步骤(1)所述来源于Pyrococcus furiosus的高温镍铁氢化酶编码基因是(a)或(b)或(c)或(d)：(a)SEQ ID NO：2；(b)与SEQ ID NO：2具有98%以上同源性的序列，且编码的蛋白具有高温镍铁氢化酶活性；(c)编码四个亚基的蛋白的核苷酸序列，其中第一个亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其中第二个亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，其中第三个亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，其中第四个亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:6；(d)编码四个亚基的蛋白的核苷酸序列，其编码的蛋白具有高温镍铁氢化酶活性，其中第一个亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有98%以上同源性，其中第二个亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有98%以上同源性，其中第三个亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO:5具有98%以上同源性，其中第四个亚基的氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有98%以上同源性。

2.根据权利要求1所述高温镍铁氢化酶异源表达方法，其特征在于，步骤(2)所述步骤(1)获得的穿梭表达载体为pTE4或pTE5，其中pTE5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；与pTE5相比，pTE4载体中高温镍铁氢化酶编码基因SEQ ID NO：2前少3个组氨酸编码基因。

3.根据权利要求1所述高温镍铁氢化酶异源表达方法，其特征在于，步骤(1)所述穿梭表达载体为pTE3、pTE2或pTE1，其中，pTE3序列为载体序列SEQ ID NO：1中缺少SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：2前的3个组氨酸编码基因；pTE2序列为载体序列SEQ ID NO：1中缺少SEQID NO：2以及SEQ ID NO：2前的12个组氨酸编码基因；pTE1序列为载体序列SEQ ID NO：1中缺少SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：2前的12个组氨酸编码基因和启动子Pcsg基因。

4.根据权利要求1所述高温镍铁氢化酶异源表达方法，其特征在于，所述Thermococcuskodakarensis为TS559，所述TS559基因型为△pyrF;△trpE::pyrF;△TK0149。

5.一种重组Thermococcus kodakarensis，其特征在于，采用权利要求1-4任一所述高温镍铁氢化酶异源表达方法构建。

6.一种高温镍铁氢化酶的纯化方法，其特征在于，步骤包括将权利要求5所述重组Thermococcus kodakarensis的菌液先低温冻存，然后将菌体融化后，加入DnaseI以及适量石英砂，涡旋震荡，进行细胞破碎，然后利用镍柱亲和层析进行纯化。

7.权利要求5所述重组Thermococcus kodakarensis在制备乳酸中的应用。