[发明专利]一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9‑ω融合蛋白及其应用。dcas9‑ω融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，该融合蛋白可被引导至特定靶向位点并与其结合，RNA聚合酶ω亚基在此位点招募RNA聚合酶其他亚基组装成RNA聚合酶，促进下游基因转录，从而提高靶基因的表达量，即融合蛋白dcas9‑ω保留dcas9的DNA结合能力与RNA聚合酶亚基的转录激活能力，从而特异性提高靶基因表达。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种表达dcas9与RNA聚合酶亚基的融合蛋白dcas9-ω，尤其涉及一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用。

背景技术

大肠杆菌表达系统是目前最常用的原核表达系统，然而，该表达系统仍存在一定的缺陷，比如外源蛋白容易形成包涵体，产内毒素等。近年来，枯草杆菌表达系统被越来越多的研究者用来表达目的蛋白。枯草芽孢杆菌具有很强的分泌能力，能将外源蛋白直接分泌到培养基中，不仅有效避免蛋白形成包涵体，且能够极大简化后续纯化步骤，降低生产成本。枯草芽孢杆菌不产脂多糖等内毒素，属于GRAS菌株，可用于生产食品、医药等相关蛋白及代谢产物。此外，目前已有很成熟的枯草芽孢杆菌遗传操作手段和大规模发酵技术。经过很多年的努力，许多原核和真核基因都已经在芽孢杆菌表达系统中得以克隆和表达，其中有的已应用于工业生产。然而，以枯草芽孢杆菌作为表达宿主表达的蛋白主要来源于芽孢属近缘种，其表达非芽孢属来源的蛋白表达能力较差，因此，如何提高外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量，是进一步开发枯草芽孢杆菌作为细胞工厂，拓展枯草芽孢杆菌应用范围的关键问题。

目前，已有多种策略用于提高外源蛋白的表达量，包括基因水平、转录水平、翻译水平及翻译后修饰方面等都可作为改造的靶点，如提高基因拷贝数、核糖体工程、密码子优化等方法。对于原核生物来说，在转录水平方面提高目的基因的转录本量以提高其表达量，这是最简单、有效的方式，比如通过启动子工程等方式筛选高效启动子，用于提高目的基因表达量。目前已有在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等构建启动子文库筛选高效启动子的报告。本发明人前期研究中在枯草芽孢杆菌中构建了以GFP为报告基因的启动子文库。然而，我们将筛选到的启动子用于表达我们的目的基因时，基因的表达量很低，且表达量与启动子强度不成比例，暗示启动子具有一定的基因特异性，即以A基因作为报告基因筛选到的强启动子用于表达B基因时，往往很难保证高效的表达量。因此，建立一种适用性更广的提高基因转录的方法尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的技术目的在于建立一种适用性更广的提高枯草芽孢杆菌外源基因转录表达的方法，基于该技术目的，本发明提供了一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用。

为了实现本发明的目的，发明人选择革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌为研究对象，通过融合表达RNA聚合酶和dcas9蛋白，首次在革兰氏阳性菌中建立了CRISPRa系统，并实现了对外源基因的特异性表达。

具体地，dcas9是一种缺失核酸内切酶活性的cas9突变体(dead cas9)，但仍保留识别向导RNA并与向导RNA靶向DNA双链结合的能力。枯草芽孢杆菌RNA聚合酶由五个亚基组成，全酶为α2ββ’σω，具有识别启动子序列，并起始和延伸DNA转录的功能。本发明将dCas9与枯草芽孢杆菌RNA聚合酶ω亚基融合表达，通过设计靶向枯草芽孢杆菌细胞中靶基因启动子上游不同区域的向导RNA，融合蛋白dCas9-ω被引导至特定靶向位点并与其结合，RNA聚合酶ω亚基在此位点招募RNA聚合酶其他亚基组装成RNA聚合酶，促进下游基因转录，从而提高靶基因的表达量，即融合蛋白dcas9-ω保留dcas9的DNA结合能力与RNA聚合酶亚基的转录激活能力，从而实现特异性提高靶基因表达。

进一步地，本发明的技术方案概况如下：一种dcas9-ω融合蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。