[发明专利]多能干细胞分化为间充质干细胞的方法及其培养基和应用

权利要求书

1.一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括：完全在3D悬浮条件下，利用BMP4和A8301将多能干细胞分化成为类滋养层细胞，再将所述类滋养层细胞分化成为间充质干细胞，且两次分化过程中无需传代或更换培养容器。

2.根据权利要求1所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，将所述多能干细胞放置于含有所述BMP4和所述A8301的第一细胞分化培养基中进行第一次分化培养，再将所述第一次分化培养得到的所述类滋养层细胞在第二细胞分化培养基中进行第二次分化培养，得到间充质干细胞；

优选地，所述第一次分化培养的时间为2-5天，所述第二次分化培养的时间为18-22天；

优选地，所述BMP4在所述第一细胞分化培养基中的浓度为5-15ng/mL，优选6-13ng/mL，更优选8-12ng/mL，所述A8301在所述第一细胞分化培养基中的浓度为0.5-1.5μM，优选0.6-1.3μM，更优选0.8-1.2μM。

3.根据权利要求2所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，所述第一细胞分化培养基包括所述BMP4、所述A8301以及基础培养基，所述基础培养基按重量份数计包括DMEM低糖培养基72-76份、血清替代物18-22份、非必须氨基酸0.5-1.5份以及3-7份L-谷氨酰胺；所述第二细胞分化培养基为所述基础培养基。

4.根据权利要求1所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，所述多能干细胞是通过初始多能干细胞经过扩增培养得到的，将所述初始多能干细胞扩增培养是将所述初始多能干细胞的细胞集落通过细胞筛切割成细胞团，再将所述细胞团在扩增培养基中进行悬浮培养；

优选地，所述细胞团进行悬浮培养的过程中添加增粘剂、基质胶、水凝胶或增稠剂，进一步优选地，所述增粘剂为食用级添加剂，更优选地，所述增粘剂为甲基纤维素，优选所述甲基纤维素的添加浓度为所述扩增培养基的质量的0.2％-0.5％；

优选地，所述扩增培养基为mTeSR1细胞培养基，且所述mTeSR1细胞培养基添加有Y27632，优选地，所述Y27632在所述mTeSR1细胞培养基中的浓度为8-12μM；

优选地，所述细胞筛的开口为50微米；

优选地，所述初始多能干细胞的细胞集落是将原始多能干细胞贴壁培养到78-82％融合度后，再用1X PBS清洗收集得到的。

5.一种用于权利要求1所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法的培养基，其特征在于，其包括第一细胞分化培养基和第二细胞分化培养基，所述第一细胞分化培养基包括所述BMP4、所述A8301以及基础培养基，所述基础培养基按重量份数计包括DMEM低糖培养基72-76份、血清替代物18-22份、非必须氨基酸0.5-1.5份以及3-7份L-谷氨酰胺；所述第二细胞分化培养基为所述基础培养基。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述BMP4在所述第一细胞分化培养基中的浓度为5-15ng/mL，优选6-13ng/mL，更优选8-12ng/mL，所述A8301在所述第一细胞分化培养基中的浓度为0.5-1.5μM，优选0.6-1.3μM，更优选0.8-1.2μM。

7.利用权利要求1-4任意一项所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法分化得到的间充质干细胞在组织器官再生上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将分化得到的所述间充质干细胞封装在细胞容器内，所述细胞容器的内部空间用干细胞培养基填充至89-91％，优选地，所述细胞容器的材质为玻璃或塑料。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述间充质干细胞进行血管内注射时，将所述间充质干细胞消化解离成单细胞后进行注射。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述间充质干细胞消化解离成单细胞包括将所述间充质干细胞与胰蛋白酶混合进行消化，优选地，所述胰蛋白酶的体积比为所述间充质干细胞的0.05-0.25％，消化时间至少为10分钟；

优选地，所述间充质干细胞经过所述胰蛋白酶进行消化后，再依次进行胰蛋白酶中和以及干细胞离心操作，优选地，进行胰蛋白酶中和的溶液为新鲜制备的基础培养基。