[发明专利]一种高亲和力EDB-FN蛋白靶向肽及其应用

说明书

本发明涉及一种纤连蛋白EDB亚型特异性的靶向短肽A16，其氨基酸序列为ATYRLFQGVEVV。本发明所述靶向短肽A16能特异性识别肿瘤细胞表达的EDB‑FN蛋白，对EDB‑FN的亲和力高，能携带具有诊断或治疗活性的功能分子到肿瘤细胞上，发挥诊断或治疗作用。

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及噬菌体展示肽库技术和重组表达技术，特别是涉及一种高亲和力EDB-FN蛋白靶向肽的筛选、鉴定、制备及应用。

背景技术

众所周知，恶性肿瘤都处在一个独一无二的微环境中，促进肿瘤细胞的生长、发散与转移。在肿瘤细胞外基质中通常会异常的高表达与肿瘤相关的蛋白，其中，纤连蛋白(fibronectin)是肿瘤细胞外基质中最重要的蛋白之一，在肿瘤的发生、生长与转移的过程中起关键作用。另外，在长期的科学研究中发现，纤连蛋白的一个重要的亚型extradomain-B fibronectin(EDB-FN)在病人体内与肿瘤的生长过程高度相关，成为医学界公认的肿瘤发生与上皮间质分化重要生物标志物。EDB蛋白在人体大多数肿瘤中都有很高的表达，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌以及淋巴瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤等。所以，EDB是一个极具发展前景的标志物对于肿瘤的精准检查、诊断以及治疗。

短肽对人体的生理过程(激素、神经递质、生长因子、离子通道配体以及抗感染)有着重要的作用。目前，得到确认的天然多肽超过7000条。通常短肽可以作为细胞表面受体高亲和性的信号分子，可以触发细胞内效应。由于短肽具有诱惑力的药理作用以及成本低的特点，一种新型的短肽靶向药物以及肿瘤精准成像正在成为医药领域的热门研究方向。应用短肽筛选技术获得与EDB蛋白具有高度结合力的十二肽具有广阔的应用前景。

噬菌体展示技术是一种快速高通量的蛋白多肽展示技术，利用噬菌体展示技术，能快速高通量的筛选高亲和的靶向抗体及功能性多肽。目前利用随机合成的方法，可以将多达109的不同多肽序列展示到噬菌体表面，建立起一个大库容的多肽库，通过优化筛选方法有可能筛选出不同需求的短肽分子。短肽分子较小易于穿膜，但通常亲和力较低，特别是当携带其它分子时经常发生脱靶现象。能否获得高亲和力的靶向多肽，除了受到筛选方法的条件和参数影响以外，很大程度上取决于随机因素。另外，短肽分子结构相对简单，作为靶向标记物时特异性通常也不高，特异性不足也影响了短肽作为靶向分子的应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过多次对噬菌体随机肽库进行反复筛选，获得了一条对EDB-FN蛋白具有特异靶向性、高度亲和力的十二肽，并验证了其携带诊断标记特异性靶向表达EDB-FN的肿瘤细胞的功能。

一方面，一种EDB-FN蛋白靶向肽A16，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述EDB-FN蛋白靶向肽还可以在SEQ ID NO:1的基础上进一步通过氨基酸的取代、缺失、添加衍生，优选在SEQ ID NO:1的基础上进行1、2、3个氨基酸的取代、缺失、添加，例如在1个位点上进行氨基酸保守性取代。

第二方面，本发明提供一种缀合物，包含靶向部分和功能性部分，其特征在于所述靶向部分为所述靶向肽A16。

本发明所述的缀合物，其特征在于所述缀合物中含有一个或多个拷贝的靶向肽A16。

本发明所述的缀合物，其特征在于所述功能性部分包括选自由诊断标记、化疗药物、活性分子组成的组。

本发明所述的缀合物，其特征在于所述缀合物的各组件之间可直接连接或通过接头连接，例如所述功能性部分与所述靶向部分之间、所述多个功能性部分之间、所述多个靶向部分之间直接连接或通过接头连接。

所述直接连接优选为肽键直接连接；所述接头连接的接头例如(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，其中n为2-6。

第三方面，本发明提供一种核酸，其编码：