[发明专利]靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法有效
| 申请号： | 201710969302.3 | 申请日： | 2017-10-18 |
| 公开（公告）号： | CN107746859B | 公开（公告）日： | 2022-03-01 |
| 发明（设计）人： | 黄昕华;徐峰波;庞勇;刘倩;李德柱;唐正晓 | 申请（专利权）人： | 银丰生物工程集团有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/864;C12N5/10 |
| 代理公司： | 山东舜天律师事务所 37226 | 代理人： | 李新海 |
| 地址： | 250101 山东省济南*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 靶向 血红蛋白 hbb 突变 基因 造血 干细胞 修饰 方法 | ||
1.一种靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：为以下方法之一：
方法一：gRNA1、gRNA2和spCas9-2.0的mRNA电转进入含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞；细胞以StemSpan基础培养基培养1天后，以rAAV-HBB转染CD34+细胞，细胞以添加有生长因子的Stemspan培养基培养，每2天计数和添加培养基维持CD34+细胞浓度在1×106cells/ml；10天后，收获细胞；
方法二：Cas9蛋白与gRNA1、gRNA2混合重组形成功能性的核苷酸蛋白复合物，电转进入CD34+细胞；细胞以StemSpan基础培养基培养1天后，以rAAV-HBB转染CD34+细胞，细胞以添加有生长因子的Stemspan培养基培养，每2天计数和添加培养基维持CD34+细胞浓度在1×106cells/ml；10天后，收获细胞；
所述gRNA1和gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、2所示；
所述rAAV-HBB，是由rAAV和HDR450bp组成的，HDR450bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述spCas9-2.0的mRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞，通过以下方法获得：取HBB突变地贫患者的脐带血100ml或骨髓50～100ml，经过Ficoll分离单个核细胞后，以CD34磁珠获取CD34+细胞，重悬在培养基中；
所述电转条件为：电转在4mm cuvette中，550V/cm,38ms；
所述添加有生长因子的Stemspan培养基，是在Stemspan基础培养基上添加TPO 、IL6、SCF、Flt3以及SR1得到的，TPO 、IL6、SCF、Flt3的终浓度均为100ng/ml，SR1的终浓度为1.0uM；
所述Cas9蛋白，是通过以下方法制备得到的：在ecoli表达质粒中，克隆cas9 cDNA到GST-7xHis-TEV site的下游，经过表达和纯化，经过TEV蛋白酶切获取高纯度的Cas9蛋白。
所述混合重组的条件为：50mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，37℃，60min。
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