[发明专利]利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用

说明书

本发明公开一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为原料发酵生产羟基丙酸，其改造途径为构建乙酰CoA生产羟基丙酸的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径的相关基因以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流，和/或辅酶工程调节胞内氧化还原平衡。本发明通过构建外源表达羟基丙酸生产途径，并对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株能够在以乙酸为碳源的培养基中生产羟基丙酸。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及构建利用乙酸生产羟基丙酸的重组大肠杆菌菌株。

背景技术

3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物，2004年美国能源部(DOE)提出了12种重要的平台化合物，3-HP排在第四位。3-HP是一种三碳化合物，其化学性质活泼，两端分别带有一个羧基和一个羟基，使得其具有广泛的应用。3-HP可以用来生产许多化合物，如，丙烯酸、1,3-丙二醇、丙烯酰胺、丙二酸等等，还可以作为聚合涂料和金属润滑油的交联剂及纺织品的抗静电剂。目前，生产3-HP的方法主要是化学合成法，如溴3-羟基丙醛氧化法、丙酸水解法和2-氰基乙醇酸碱法。有报道指出，在高温下利用丙烯酸与水直接反应来生产3-HP，得到的产率、转化率和含量分别为62.3％、31.1％和98.4％。这种化学合成法与传统的化学合成法相比工艺简单，无需催化剂，产品含量高，后期的分离也相对容易。因此，这种方法生产3-HP成为市场上的主要来源。但是，化学合成法存在很多问题，如生产难度大，工艺需要高温高压，安全性低，生产成本高。因此，近几年来越来越多的国内外研究者试图通过生物合成法生产3-羟基丙酸。相比与化学合成法，微生物发酵法生产3-HP具有条件温和，节约能源，可利用非石油的可再生资源，环境友好等的特点。但天然微生物生产3-HP的产量很低，因此，要想提高3-HP的产量，对微生物的遗传特性进行修饰改造是有必要的。

目前利用代谢工程手段构建的3-HP的生产菌通常以E.coli或K.pneumoniae为宿主。K.pneumoniae是兼性厌氧菌，其能够天然生产微生素B12，且其具有较高的甘油耐受力和较高的转化率，由于其生化特性与大肠杆菌非常相近，从而使其成为研究甘油生物歧化过程的工具菌，使其能够利用甘油为底物来生产3-HP，且其甘油的代谢机理已经研究的很透彻。但利用K.pneumoniae以甘油为底物厌氧生产3-HP，但也存在不少问题：DhaB对氧很敏感，在有氧条件下很快失活；DhaB的催化作用严格依赖辅酶B₁₂，克雷伯氏菌虽能生产辅酶B12，但在有氧条件下生成量很少，必须额外加入；克雷伯氏菌生长较慢，发酵条件不好控制等，由于这些因素的限制使得3-HP工业化受到限制。另一方面，E.coli的遗传学背景、分子生物学、生物化学以及生理学方面的研究已非常深入，有不少的研究报道选择E.coli为宿主菌并对其进行分组改造来生产3-HP。在大肠杆菌中以葡萄糖为底物生产3-HP，Park课题组通过过表达来自橙色绿屈挠菌的NADPH依赖的丙二酰-CoA还原酶基因(mcr),重组菌在好氧条件下摇瓶培养24h生产3-HP为0.71mM，同时过表达乙酰-CoA羧化酶和生物素酶，3-HP最终浓度提高了2倍，再过表达NADH转氢酶编码基因pntAB，3-HP的浓度提高到2.14mM。但利用重组大肠杆菌生产3-HP，往往需要在培养基中额外添加昂贵的辅酶B12。但利用乙酸来生产3-HP目前仍未有报道。