[发明专利]辅基连接臂、其合成方法与二泛素的合成方法

说明书

本发明提供了一种辅基连接臂的合成工艺以及利用辅基连接臂合成二泛素的方法.本申请提供的辅基连接臂易于合成，易储存，化学性质稳定；利用新型辅基连接臂合成二泛素的过程中，化学连接效率高，能够在生理条件下进行蛋白连接；新型辅基连接臂移除条件温和，避免当前化学合成蛋白质泛素化的辅基移除过程中严酷的非变性条件。

技术领域

本发明涉及二泛素的合成技术领域，尤其涉及辅基连接臂、其合成方法与二泛素的合成方法。

背景技术

泛素化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰，几乎参与调控真核生物中所有细胞过程，包括细胞周期、转录激活、蛋白降解等。泛素本身可以作为底物，在8个位点(M1，K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63)的基础上形成不同链连接类型、不同链长的多聚泛素链。

目前，有诸多方法(如蛋白质全合成法，酶法，基因编码法等)可以合成多聚泛素链。蛋白质全合成法受限于化学合成步骤繁琐以及难以在生物实验室中获取。酶法能获取除K27-linked二泛素以外的所有的二泛素，受限于难以获得高度均一的足量的多聚泛素链。基因编码的方法受限于非天然氨基酸难以嵌入、蛋白质表达效率低以及没有特定生物正交的tRNA/氨酰tRNA合成酶分子对。因此，有必要发展一种方法用于快速、高效获取高度均一的足量的二泛素。

当前，Chuan-Fa Liu及其同事设计合成了甘氨酸辅基，并用于二泛素的合成。该辅基合成步骤繁琐、空间位阻大、脱除条件苛刻。Tom W.Muir及其同事发现光敏感辅基用于组蛋白的泛素化，但该辅基位阻大、化学连接反应效率低。Champak Chatterjee及其同事发现2-aminooxyethanethiol能够在生理条件下进行蛋白片段的连接，并且辅基移除条件温和。基于此，本申请提供了一种新型辅基。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种应用于制备二泛素的辅基连接臂及其合成方法，本申请合成的辅基连接臂应用于二泛素的制备具有化学连接率高，且辅基连接臂移除条件温和。

有鉴于此，本申请提供了一种应用于制备二泛素的具有式(Ⅰ)结构的辅基连接臂的合成方法，包括以下步骤：

A)，将具有式(Ⅱ)结构的化合物与具有式(Ⅲ)结构的化合物在碱性化合物的催化作用下反应，得到具有式(IV)结构的化合物；

在催化剂的作用下，将具有式(IV)结构的化合物在甲醇中反应，得到具有式(Ⅴ)结构的化合物；

将N-羟基邻苯二甲酰亚胺与具有式(Ⅵ)结构的化合物在催化剂的作用下反应，得到具有式(Ⅶ)结构的化合物；

B)，在催化剂的作用下，将具有式(Ⅴ)结构的化合物与具有式(Ⅶ)结构的化合物反应，得到具有式(Ⅷ)结构的化合物；

C)将具有式(Ⅷ)结构的化合物在催化剂的作用下反应，得到具有式(Ⅰ)结构的辅基连接臂；

其中，X₁为卤素；

R为C1～C5的烷基；

X₂与X₃独立的选自卤素。

优选的，所述具有式(Ⅲ)结构的化合物为硫代乙酸或硫代丙酸，所述具有式(Ⅵ)结构的化合物为1,2-二溴乙烷或1-溴-2氯乙烷。

优选的，在得到具有式(IV)结构的化合物的步骤中，所述碱性化合物为碳酸钾；在得到具有式(Ⅴ)结构的化合物的步骤中，所述催化剂为浓盐酸；得到具有式(Ⅶ)结构的化合物的步骤中，所述催化剂为三乙胺；步骤B)中所述催化剂为三乙胺；步骤C)中所述催化剂为水合肼。