[发明专利]一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法

权利要求书

1.一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：将待切片的根结放置流水下清洗干净，将根结剪成1.0-1.5cm小段；

S2：准备医用针筒，用手指按住针头插孔，将根结放入针筒中，倒入FAA固定液，插上针头及针筒并使针头朝上，反复推拉，直至观察到FAA固定液中无气泡产生为止，此时根结中的空气已被抽出；

S3：抽真空结束后，将根结放入玻璃固定瓶中，加入FAA固定液浸泡，加入量沒过根结组织即可；固定20-24h后即可进行下一步石蜡切片操作，如暂时还未进行后续实验，可放置4-6℃冰箱进行保存；

S4：准备纱布包裹根结，并用棉线扎住纱布封口，然后用橡皮筋将纱布固定在离心管上，放置在流水下冲洗24h；

S5：将根结放入离心管中，加入10-15ml，2％丙酸，浸泡2d；

S6：将根结放入离心管中，加入2％丙酸溶液与爱利氏苏木精染液的混合液染色，混合液比例为2:1，浸泡4d；

S7：染色后根结需再次进行流水冲洗，冲洗时间为24h，最后用蒸馏水浸泡0.5h-1h；

S8：准备离心管进行脱水，每次脱水前用纱布吸干根结上的水分，按照15％、30％、50％、70％、80％、95％乙醇浓度逐级各脱水一次，每次1.5h；最后进行无水乙醇脱水两次，每次各60min；

S9：准备若干个离心管，在离心管中加入20ml无水乙醇与5ml氯仿的混合液浸泡根结，时间30min，后逐次吸出5ml混合液，再加入5ml纯氯仿，如此反复4次，每次30min，最后再换上纯氯仿15ml，浸泡20min；

S10：往装有15ml纯氯仿浸泡根结的离心管中，加入熔化的石蜡，每次加入5ml纯石蜡，一共三次，每次浸蜡时间为1h；每次加蜡后立即将离心管置于38℃-40℃恒温水浴锅中，避免石蜡凝固，三次加蜡完成后继续将离心管置于38℃-40℃恒温水浴锅中浸蜡2～3d；然后按照1/2二甲苯加1/2石蜡浸泡根结，置于42℃恒温水浴锅中45min；接着1/4二甲苯加3/4石蜡浸泡根结，置于48℃恒温水浴锅中45min；最后利用纯蜡浸泡根结，置于58℃恒温水浴锅中60min，纯蜡浸泡需重复三次；

S11：取出根结置于58℃展蜡台，使根结材料周围的蜡块熔化；往预先折叠好的包埋模具中倒入纯石蜡，温度为58℃-70℃，避免组织烫坏发生皱缩，用镊子将根结置于包埋模具蜡液中间位置，在蜡液未凝固之前调整好根结包埋角度，如果包埋样本过大，要保证各个根结材料之间有一定距离，以便于后期蜡块修整；包埋完成后静待石蜡在自然温度下凝固，卸下包埋模具；

S12：利用锋利刀片将石蜡块修整为小长方体，用力不宜过猛，导致石蜡块切碎；小长方体六面要平整，根结材料四周要留有多余的石蜡，不能使根结材料组织暴露于石蜡外；

S13：将修好的石蜡黏在小木块上，固定于手动轮转式切片机上，设置好切片厚度；切片过程中，摇动切片手柄的力度要适当，速度均匀一致，切片动作保持轻缓，不宜用力过度，否则会导致石蜡不成型且皱褶甚至石蜡破碎；从开始切片时，就用计数器进行计数，并记下刀位数，切至观察到石蜡中无根结组织出现为止，连片的石蜡需提前区分好组织正反面，用镊子小心轻缓放置于贴片板上，反面朝下，备用；

S14：贴片前，根据切片总刀数，取总刀位数除以2的前后10片进行贴片；首先用HCL浸泡载玻片24-48h，再用流水清洗干净，以确保载玻片无杂质进而影响后期观察；然后在载玻片上均匀涂抹10-15μL 0.2％聚乙烯亚氨，备用；每张载玻片上滴一滴纯水，利用锋利刀片切断石蜡，每十刀石蜡一组，放置到载玻片上，反面朝下；

S15：将带有石蜡的载玻片置于38-40℃的展蜡台上，保持温度不变，烘烤3-5h，烘干表面水分；

S16：将载玻片放入TO型生物制剂中，脱蜡50min，直至置于显微镜下观察到植物根结组织结构清晰即可；

S17：脱蜡后将载玻片稍微晾干3-5min，用枪头沾取中性树脂胶，快速滴于含有植物组织的位置，并倾斜放下干净的盖玻片即可；

S18：将已封片的玻片置于光学显微镜下进行观察，并拍照保存。

2.根据权利要求1所述的一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，其特征在于：步骤S1所述的根结，为按照植物根组织生长方向将根结两端剪成上端0.3-0.5cm长和下端0.7-0.9cm长，根结形态为一边膨大，膨大角度以根结中柱与根组织中柱的夹角进行衡量，夹角范围是40～60°。