[发明专利]一种襄麦冬内生曲霉菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用

权利要求书

1.一种襄麦冬内生曲霉菌属真菌在制备甾体皂苷中的应用，其特征在于：所述的曲霉菌属真菌EF019分离自襄麦冬（Liriope spicata var . proliferaY .T .Ma）的活体块根，经18S rDNA序列鉴定为曲霉菌属（Aspergillus sp），所述的曲霉菌真菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年12月7日，保藏编号为：CCTCC No.M2016721；采用所述的曲霉菌菌株通过液体发酵制备得到襄麦冬甾体皂苷；

液体发酵的培养基是马铃薯液体培养基（PDB），所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水；

襄麦冬甾体皂苷的制备步骤如下：

(1)取所述的曲霉菌属真菌菌株菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；

(3)将配制好液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用，无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；

(4)发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，研磨粉碎；

(5)将发酵粉碎物转入锥形瓶中，加入100ml 75%乙醇60℃水浴 .5小时后，过滤，得滤液；同时，滤渣再加入100ml的75%乙醇，继续水浴1.5小时后再次过滤，合并2次滤液；

(6)对滤液采用减压浓缩方法，去除乙醇，得到浸膏，加入100ml纯水溶解；

(7)将上述浸膏水溶液转入分液漏斗中，加入40ml乙醚进行充分萃取，去除乙醚层，保留水层；

(8)将水层溶解物转至新的分液漏斗中，加入100ml水饱和正丁醇进行充分萃取，去除水层，保留正丁醇层，减压浓缩去除正丁醇后，得浸膏，加入甲醇复溶得襄麦冬甾体皂苷；

曲霉菌属真菌的分离步骤是：

(1)将清洗干净的襄麦冬块根用75%(V/V)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4-6%的次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；

(2)将上述襄麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成0.5cm×0.5cm组织小片，含氨卞青霉素的PDA培养基上，所述氨卞青霉素的终浓度为50ug/ml，每皿植入2片，用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；

(3)5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，最终得到襄麦冬内生曲霉菌真菌EF019；

曲霉菌属真菌18S rRNA基因序列如下：

GGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGACCTCTCGGCCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTATACTAGA。