[发明专利]定性分析阿胶糕中胶类来源的方法

权利要求书

1.一种定性分析阿胶糕中胶类来源的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)明胶的提取和纯化

(1-1)配制阿胶糕的分散液，将所得分散液进行过滤并收集滤液；

(1-2)将步骤(1-1)收集的滤液与丙酮进行接触，并将接触后的混合物依次进行冷却静置处理和离心分离，收集离心分离后得到的沉淀物，其中，所述丙酮与所述滤液的用量的体积比为3-6：1；

(1-3)将步骤(1-2)收集的沉淀物重新分散于水中，然后进行超滤处理，收集分子量范围在5000-30000Da的截留液，并将得到的截留液进行冷冻干燥，收集冷冻干燥物，得到纯化的明胶；

(2)明胶的酶解

(2-1)在碳酸氢铵溶液的条件下，使用胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶对步骤(1)得到的纯化的明胶进行酶解反应，所述胞内蛋白酶Lys-C、胰蛋白酶和纯化的明胶的用量的重量比为1：0.5-1.5：10-200，所述胞内蛋白酶Lys-C的酶活力为2000-4000u/mg，所述胰蛋白酶的酶活力为5000-10000u/mg；

(2-2)在酶解终止剂的存在下，终止上述酶解反应，得到最终酶解产物；

(3)明胶酶解产物的分离和检测

(3-1)对步骤(2)得到的最终酶解产物进行脱盐处理；

(3-2)利用高效液相色谱仪-线性离子阱轨道阱高分辨率组合型质谱仪联用装置对步骤(3-1)经过脱盐处理的酶解产物进行分离和检测，并记录得到的质谱图，其中，所述线性离子阱轨道阱高分辨率组合型质谱仪的扫描模式为单离子检测扫描模式，所述单离子检测扫描模式的工作参数为：采谱区间间隔为100-300Da，采谱时间为60-120分钟；

(4)数据分析

(4-1)确定驴皮阿胶、猪皮明胶和牛皮明胶的特征性多肽；

(4-2)使用质谱图分析软件鉴定步骤(3)记录的质谱图中的特征性谱峰，并与步骤(4-1)中确定的驴皮阿胶、猪皮明胶和牛皮明胶的特征性多肽进行比对，确定驴皮阿胶、猪皮明胶和牛皮明胶分别占总明胶含量的1重量％时的特征性多肽的质谱信息。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1-2)中，滤液与丙酮接触后，所述冷却静置处理的条件包括：处理温度为-25℃至-15℃，处理时间为0.5-2小时；所述离心分离的条件包括：离心转速为3000-6000g，离心时间为10-20分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1-3)中，所述超滤处理在离心超滤装置中进行，所述离心超滤装置的工作条件包括：离心转速为3000-6000g，离心时间为20-40分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2-1)中，所述碳酸氢铵溶液的浓度为10-100mmol/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2-1)中，所述酶解反应的过程包括：先使用胞内蛋白酶Lys-C对步骤(1)得到的纯化的明胶进行第一酶解反应，得到第一酶解产物，再使用胰蛋白酶对第一酶解液进行第二酶解反应，得到第二酶解产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一酶解反应的条件包括：所述胞内蛋白酶Lys-C和明胶的用量的重量比为1：10-200，反应温度为20-50℃，反应时间为1-24小时；所述第二酶解反应的条件包括：所述胰蛋白酶和明胶的用量的重量比为1：10-200，反应温度为15-50℃，反应时间为4-30小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2-2)中，所述酶解终止剂为三氟乙酸，所述酶解终止剂的浓度为30-70mg/mL，所述酶解终止剂的的用量与步骤(2-1)得到的混合溶液的用量的体积比为1：10-20。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3-1)中，所述脱盐处理的过程包括：将所述最终酶解产物注入高效液相色谱仪，处理时间为3-10分钟。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3-2)中，所记录得到的质谱图包括一级质谱图和二级质谱图。