[发明专利]一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种泛生菌酰胺酶突变体、基因、工程菌及其应用，所述酰胺酶突变体是将SEQ ID No.2所示泛生菌酰胺酶氨基酸序列第105位、175位、301位、305位或309位进行单突变或多突变获得的。本发明提供的泛生菌酰胺酶突变体较亲本活力提高2～3倍，对底物2‑氯烟酰胺的耐受能力超过200mM，通过补料甚至超过1M，并且转化率仍能够保持在95％以上。利用本发明中所述的补料方法能够有效减轻2‑氯烟酸对酰胺酶或菌体的产物抑制效应，在保证较高催化效率的同时使得产物2‑氯烟酸尽可能地析出，方便产物的提取纯化。因此，本发明的酰胺酶突变体可以可用于酶法工业化生产2‑氯烟酸。

(一)技术领域

本发明涉及一种2-氯烟酸的制备方法，特别涉及一种泛生菌酰胺酶突变体、编码基因，及其在水解2-氯烟酰胺制备农药、医药中间体2-氯烟酸中的应用。

(二)背景技术

2-氯烟酸(2-Chloronicotinic Acid，简称2-CA)，又称2-氯-3-吡啶甲酸，属于烟酸的2位氯代化合物。2-氯烟酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药和医药工业。在农药领域，2-氯烟酸可用于合成杀菌剂、杀虫剂和除草剂等，如烟嘧磺隆、吡氟草胺等(农药,2003,42,5-8；农药,2013,565-567)；在医药领域，可用于合成多种抗生素、心血管疾病治疗药物等，如抗艾滋病药物奈韦拉平，抗抑郁药物米氮平，非甾体消炎镇痛药尼氟灭酸、普拉洛芬以及烟甲灭酸等(化学与生物工程,2008,25,5-8；药学研究,2009,28,485-487；US5,569,760；精细化工中间体,2009,39,37-39)。2016年国内2-氯烟酸的需求量达3350吨(合成化学,2016,620-623)，市场需求巨大，应用前景广阔。

目前，2-氯烟酸的工业生产主要采用化学法，可分为两大方法(合成化学,2011,19,285-286)：一是基于已有的吡啶环母体(CN101817781；CN104513198；CN103848783)，直接进行氯化或引入相应官能团；二是利用适当的活性直链化合物，通过接枝和闭环反应合成(CN102993092；CN103193705；CN104592104)。然而，以上两种化学法均存在工艺步骤冗长，条件苛刻，收率低，副产物多，环境负担重等问题。近年来，生物催化因其环境友好、选择性高、能耗低、催化剂可降解等优点，已迅速发展成为大宗及精细化学品制造的重要方法。因此，开发能够高效制备2-氯烟酸的生物催化剂具有重要意义。

目前，有关生物法制备2-氯烟酸的研究较少，主要是利用酰胺酶水解2-氯烟酰胺制备2-氯烟酸(CN101857889；New Biotechnol.,2011,28,610-615；Catal.Commun.,2013,38,6-9；Protein Expres.Purif.,2016,126,16-25；Enzyme Microb.Technol.,2016,86,93-102)。酰胺酶(Amidase，EC 3.5.1.x)是一类能够催化酰胺键断裂生成相应羧酸的水解酶，底物谱广，能高效催化各种脂肪族、芳香族以及杂环族酰胺水解。酰胺酶因其具有良好的化学和立体选择性，在医药、农药中间体制备方面中极具潜力，日益受到工业界重视。然而，已有的研究报道表明，酰胺酶水解2-氯烟酰胺的催化效率普遍较低。因此，提高酰胺酶催化2-氯烟酰胺的水解效率，以实现工业应用十分必要。

(三)发明内容

本发明的目的是通过蛋白质定点饱和突变技术对泛生菌来源的酰胺酶(Pa-Ami)进行改造，提供一种突变体蛋白，提高其对2-氯烟酰胺的水解活力，从而有利于该酰胺酶在2-氯烟酸合成中的应用。

本发明采用的技术方案是：