[发明专利]霍山石斛提取物在调控血糖方面的应用

权利要求书

1.霍山石斛提取物在制备调控血糖药物中的应用，其特征在于，所述应用是通过促进P13K/AKT信号通路，增强对葡萄糖的转运和利用途径起作用，该药物用于缓解糖尿病病情；其中，所述霍山石斛提取物的获取方法为：

(1)取霍山石斛切片，50℃烘干后研磨成粉末；80％乙醇脱去色素，50℃水提5h；95％乙醇，过夜醇沉；60％蒸干，得霍山石斛粗多糖；

(2)采取Sevage联合木瓜蛋白酶法脱蛋白，接着进行透析、真空冷冻干燥，得霍山石斛多糖；采取Sevage联合木瓜蛋白酶法脱蛋白的具体方法为：在获取的霍山石斛粗多糖中加入2％木瓜蛋白酶，50℃水浴2h，再按照霍山石斛粗多糖溶液：正丁醇：氯仿体积比例为25：1：5加入反应试剂，反复操作4-5次，直到无蛋白层；

(3)选择阴离子交换层析法对霍山石斛多糖进行分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩至100-200mg生药/mL，滤过即得；具体工艺为：

A、DEAE-52离子柱层析

选择阴离子交换层析法对霍山石斛多糖进行分离纯化，填充介质为DEAE-52；DEAE-52柱层析的流程如下：

①准备工作

霍山石斛多糖：称量0.1g的多糖，溶于50mL蒸馏水中，配制浓度为20mg/mL多糖溶液；梯度洗脱液的配制：配制0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/LNaCl和0.5mol/LNaOH；

②梯度洗脱

DEAE-52进行预处理并填充至层析柱中，启动自动收集器，按设置好的程序运行1mL/min，5min/管，洗脱液按照NaCl溶液浓度从低到高依次进行，最后换用0.5mol/LNaOH；

③苯酚-硫酸跟踪检测每个试管中多糖的含量，绘制洗脱曲线，收集到三个峰值下的洗脱液，将其分别命名为DPI、DPII、DPIII；

④将三个组分DPI、DPII和DPIII分别进行细胞实验，检测其是否具有降血糖的活性，其中，DPII的活性最佳，将其用于后续实验；

B、SephadexG-100柱层析

对DEAE-52纯化后的DPII组分做进一步的分离纯化，此时填充介质为更改为SephadexG-100；参照DEAE-52柱层析操作步骤，配制0.05mol/LNaCl为洗脱液，洗脱速度1mL/min，4min/管，绘制洗脱曲线，将DPII组分经SephadexG-100进一步的洗脱后，只得到一个洗脱峰；收集该洗脱峰下洗脱液，浓缩至100-200mg生药/mL，滤过，作为最终所需的霍山石斛提取物；

C、成分分析

对最终获得的霍山石斛提取物进行成分分析，根据GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用得出的离子峰碎片及单糖组成可得出：DPII组分主要链接方式由1,3,4-Rha，1,4-p-Glc，1,3,4-Glc，还有阿拉伯糖和木糖组成的糖苷键，分子量为48365Da。

2.根据权利要求1所述的霍山石斛提取物在制备调控血糖药物中的应用，其特征在于，所述霍山石斛提取物通过上调磷酸肌醇激酶来激活胰岛素受体下游的PI3K的表达，产生NADP，刺激Ca2+依赖的蛋白激酶，促进葡萄糖转运蛋白对葡萄糖的转运，降低血糖值。

3.根据权利要求2所述的霍山石斛提取物在制备调控血糖药物中的应用，其特征在于，所述霍山石斛提取物通过上调CAMP，启动信号级联反应，促进细胞内Ca2+浓度上升，增加糖酵解和蛋白合成过程的进行。

4.根据权利要求1所述的霍山石斛提取物在制备调控血糖药物中的应用，其特征在于，所述药物是以霍山石斛提取物为活性成分的药物组合物。

5.根据权利要求4所述的霍山石斛提取物在制备调控血糖药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物含药物活性物质10-100mg，其余为药学上可接受的载体。