[发明专利]一种富硒酵母培养工艺的优化方法及工艺

权利要求书

1.一种富硒酵母培养工艺的优化方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（1）选取酿酒酵母；

（2）培养基的培养：培养基组分包括葡萄糖、蛋白胨和酵母膏，对这三个成分因素进行正交实验，得出发酵培养基的最佳配方，其中，正交实验时，装液量为50 mL/ 250 mL，接种量为5 %，温度为30 ℃，pH 为自然，转速为200 rpm，发酵48 h后测定其菌泥生物量；

（3）培养条件的优化：采用正交实验，优化转速、温度、初始 pH 这三个变量，其中，装液量为 50 mL/ 250 mL，接种量为 5 %，发酵48 h后测定其菌泥生物量；

（4）富硒条件的优化：正交实验结果，确定了酿酒酵母的最适的培养条件，选择不同添加时间、添加方式来添加亚硒酸钠，进行优化，达到硒的最大化利用；

（5）生产效率测定：采用干重法，将菌泥发酵液 5000 rpm 离心 5 min，弃去上清液并收集菌泥，之后将培养的菌泥冷冻干燥机中冻干，其中，生产效率 g/L= 富硒产品干重 g÷ 液体培养基的体积 L；

（6）硒的测定：利用 3,3-二氨基联苯胺比色法对硒的含量进行测定；

（7）总硒含量的测定：

酵母菌泥中硒含量测定：准确称取 1 g 富硒产物，放入烧瓶中，加入 10 mL 消化液，4℃消化至无色透明为止，待冷却后，将此消化液转入 50 mL 容量瓶中，用NaOH 调节 pH到 7.0 左右，最后将溶液定容到 50 mL，最后取 10 mL 消化样液，按 DAB比色法计算硒含量；

（8）有机硒含量；

准确称取酵母富硒产物 0.5 g，放入透析袋中，充分透析 24 h 后去除无机硒，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定；

（9） 综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度；

富硒量 µg/g = 总硒含量 µg ÷ 菌泥干重 g；

有机硒转化率 % = 有机硒含量 µg ÷ 总硒含量 µg × 100%；

（10）氨基酸的测定：

氨基酸的测定是利用反相高效液相色谱HPLC完成，该测定配备了Hypersil ODS C18色谱柱，色谱柱为4 mm×125 mm，以 1 mL/min 的流速进行梯度洗脱，柱温为 40℃，移动相的配置为：缓冲液 A： 0.8 g 醋酸钠溶于 500 mL 超纯水，加入 90μL 三乙胺和 2.9 mL四氢呋喃，最后用醋酸将 pH 值调整为 7.2±0.05；缓冲液 B： 0.8 g 醋酸钠溶于 100 mL超纯水，加入 200 mL 甲醇，最后用醋酸将 pH 值调整为 7.2±0.05；洗脱程序设置为：缓冲液 A/ 缓冲液 B分别为 100:0， 50:50， 0:100， 0:100， 100:0 和 100:0，对应的时间分别是 0， 17， 20， 20.1， 24 和 24.1 min；邻苯二甲醛作为衍生试剂，检测波长设置为338 nm，262 nm 用于检测脯氨酸；标准氨基酸均用 0.1 M HCl 配置成浓度为 1 mM 的储液，样品中各氨基酸的含量，通过标准品绘制的标准曲线计算得来，所有样品分析三次，取平均值；

（11）数据处理与分析：

试验数据进行单因子方差分析，多重比较，结果以平均数士标准差表示；

所述步骤（4）中，向培养基中加入2 mg/L丝氨酸，以获得亚硒酸钠的最大转化率；

所述步骤（4）中，富硒条件的优化的具体步骤如下：

①硒含量的优化：

分别选取0，20，40，60，80，100 μg/mL的七个设计点，培养48 h 后测定菌体含量，单位硒含量以及有机硒转化率；

②按不同添加时间添加：将60μg/mL亚硒酸钠浓度分别在发酵0，12，24，36 h时加入培养基；

③按不同的添加方式添加：

组Ⅰ：在发酵开始就将亚硒酸钠加入培养基；

组Ⅱ：将60μg/mL亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；

组Ⅲ：将60μg/mL亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入；

④4.4丝氨酸添加方式的优化：

组Ⅳ：在发酵开始时就将向其中加入2mg/L丝氨酸；

组Ⅴ：将丝氨酸含量等分为两份，分别在发酵开始和12h后加入；

组Ⅵ：将丝氨酸含量等分为三份，分别在发酵开始，12h和24h后加入。