[发明专利]利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用

说明书

本发明公开一种利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为碳源发酵生产丙酮或异丙醇，其改造途径为构建乙酰CoA生产丙酮或异丙醇的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径相关基因的表达以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流。本发明通过对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株能够在以乙酸为碳源的培养基中生产丙酮及异丙醇。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及利用乙酸生产丙酮或异丙醇的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用。

背景技术

丙酮，又名二甲基酮，其用途十分广泛，主要可作为各种多聚物的溶剂、及稀释剂、电子产品去油的洗涤剂、各种维生素、激素及石油脱蜡的萃取剂等；另外，丙酮作为一种化工原料，也可以用来生产甲基丙烯酸甲酯、双酚A，进而用来合成聚碳酸脂塑料。丙酮的生产方法主要有丙烯直接氧化法、异丙醇法、异丙苯法、发酵法。目前，约有83％的丙酮通过不可再生的化石原料生产而来，由于化学合成的缺点，利用可再生资源通过生物合成法合成丙酮受到极大关注，据报道，通过丙酮-丁醇-乙醇发酵生产丙酮可以替代由70％化石原料来源的丙酮。

利用发酵法生产丙酮的菌株主要为丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum(Microbiol.Rev.1986，50,484–524)，丙酮丁醇梭菌为能够产生丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽孢杆菌。丙酮的生产主要是由乙酰CoA经过硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶几步酶催化反应而得到。此外，也有研究工作表明将丙酮丁醇梭菌的丙酮生产途径的关键基因thlA、adc、ctfAB转入E.coli ER2275、ATCC11303、MC1060中，利用葡萄糖为碳源可以发酵生产丙酮，E.coli ER2275(pACT)和ATCC11303(pACT)在摇瓶发酵中能够产生40mM丙酮，且在培养基中添加乙酸有利于丙酮的积累(Appl.Environ.Mircrobiol.1998,64,1079-1085)。Antje等利用Bacillus subtilis来源的硫酯酶teII_srf或Haemophilus influenzae来源的ybgC代替thl基因，消除了转移CoA时对乙酸的依赖(Metab.Eng.2013,15,218-225)。

异丙醇，又名二甲基甲醇，作为有机原料和溶剂有着广泛用途。作为化工原料，可生产丙酮、过氧化氢、甲基异丁基酮、二异丁基酮、异丙胺、异丙醚、异丙基氯化物等。在精细化工方面，可用于生产硝酸异丙酯，黄原酸异丙酯、亚磷酸三异丙酯、异丙醇铝以及医药和农药等，也可用于生产二异丙酮、醋酸异丙酯和麝香草酚以及汽油添加剂。异丙醇的生产方法主要有丙烯的间接水合法和直接水合法。许多梭菌如：Clostridium beijerinckii和Clostridium isopropylicum IAM 19239都具备异丙醇的生产能力。有研究表明，在大肠杆菌中转入丙酮合成途径的基础上引入梭菌来源的乙醇脱氢酶能够利用葡萄糖生产异丙醇。Hanai等将大肠杆菌来源的atoDA代替梭菌来源ctfAB使得摇瓶发酵产生81.6mM异丙醇(Appl.Environ.Mircrobiol.2007,73,7814-7818)。Kentaro等通过气体剥离方式提高了发酵批培养时异丙醇产量，经240h可获得2378mM异丙醇(J.Biosci.Bioeng.2010，110,696-701)。