[发明专利]CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用

说明书

本发明公开了一种CD3单链抗体‑iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用。本发明将穿透肽iRGD成分作为实现肿瘤主动靶向性、高穿透性的分子，将CD3的单链抗体与其连接，形成一个可以活化T细胞并能有效靶向杀伤肿瘤细胞的融合蛋白。成功构建后经反复实验验证，本发明具有明确肿瘤靶向性和高穿透性，能够切实地增强免疫细胞的抗肿瘤治疗效果，应用于抗肿瘤药物中。

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，特别涉及一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用。

背景技术

在越来越引起人们重视的免疫治疗领域，尽管存在类似于嵌合抗原受体T细胞疗法、BiTE等可以实现肿瘤的靶向性，但却在实体瘤的治疗中进展缓慢。免疫细胞难以有效进入肿瘤组织是其中一个重要的原因。因此，在免疫细胞治疗中，同时改善免疫细胞的主动靶向性与穿透性是进一步提高抗肿瘤治疗效果的关键。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白（命名为anti-CD3-iRGD）同时提供上述融合蛋白的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用。

本发明利用含有靶向穿透肽iRGD成分的物质作为实现肿瘤主动靶向性、高穿透性的分子，将CD3的单链抗体与其连接，形成一个可以活化T细胞并能有效靶向杀伤肿瘤细胞的融合蛋白。成功构建后经反复实验验证，本发明具有明确肿瘤靶向性和高穿透性，能够切实地增强免疫细胞的抗肿瘤治疗效果，应用于抗肿瘤药物中。

本发明提供的技术方案是：

本发明提供一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，所述融合蛋白由靶向人CD3单链抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽（比如：GGGGSGGGGSGGGGS）连接组成。

进一步地，所述融合蛋白包含但不限于CD3单链抗体、单域抗体、单克隆抗体以及能活化T细胞的CD3功能域或其他能活化T细胞的分子，肿瘤靶向穿透肽包含但不限于iRGD、iNGR，以及含前述靶向穿透肽结构的融合肽、融合蛋白或其它修饰成分。

进一步地，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：

（1）由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

（2）与序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同源性在80%-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

（3）SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由（1）衍生的蛋白。

本发明制备所述CD3单链抗体-iRGD融合蛋白的具体制备方法如下：

（1）表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD的构建：

表达载体由南京金斯瑞公司合成，且已完成对该质粒的验证，包括核酸电泳及DNA测序；

（2）将表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD转化至表达菌株BL21 DE3：

取已经确认的100ng/μL表达载体pET28a-anti-CD3-iRGD 0.1μL-5μL转化入表达菌株BL21 DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克隆低温冰箱内甘油保存该菌种；

（3）重组anti-CD3-iRGD的诱导表达,变性和复性，及纯化：

1）重组anti-CD3-iRGD 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达：

对重组anti-CD3-iRGD用1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4小时后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳；

2）重组anti-CD3-iRGD进行变复性；