[发明专利]一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法及其应用，该方法包括以下步骤(1)将双链DNA片段或RNA/DNA杂合体片段变性，使其成为单链DNA；(2)在单链DNA的3′端连接一种单链接头；(3)对连接单链接头的单链DNA用DNA聚合酶延伸，使其成为双链DNA；(4)向双链DNA的另一端连接T接头或者Tn5标签接头；(5)通过PCR扩增两端连接接头的双链DNA，使其成为下一代测序技术可测序的DNA文库。本发明的方法不仅可用于下一代测序文库的构建，测定DNA序列，还可以鉴定染色质开放区、基因表达检测、微量核酸扩增等，是一种在核酸检测分析领域具有多种功能和广泛应用价值的新方法。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于单链接头文库制备(Singlestrand Adaptor Library Preparation，SALP)的下一代测序(next-generationsequencing,NGS)文库的构建方法及其应用。

背景技术

自从2005年下一代测序(next-generation sequencing,NGS)出现在市场上以来，这项技术改变了我们在基础、应用和临床研究领域对科学研究方法的看法。随着各种新方法和计算机运算能力的不断发展，NGS平台推动了过去几年生物学知识的爆炸式增长。作为NGS最主要的应用，人类基因组的重测序极大的加深了我们对遗传多样性与健康、疾病之间相互关系的认识。NGS与传统的Sanger测序相比，最大的不同在于NGS需要制备测序文库。随着NGS测序平台数据量产出不断增加，以及各种相关硬件和软件的不断优化，测序文库的制备已经成为应用这项技术的瓶颈。

现有的标准建库流程全部在体外(in vitro)进行，主要步骤包括：DNA片段化(超声或酶切)(DNA fragmentation)、末端修平(end polishing)、加A(A tailing)、Y接头连接(adaptor ligation)、片段选择(size selection)，以及PCR扩增(PCR amplification)。标准建库流程冗长繁琐，许多步骤都需要进行优化，导致样品大量损失。特别是，该建库过程中，为了接头连接步骤的效率，接头连接前须对DNA片段进行多酶混合物处理的末端修平(end polishing)(使DNA片段的两端均成为平末端(blunt end))步骤，以及必不可少的末端加A(A tailing)步骤。虽然有不少公司推出了这些步骤的合并或优化方法，也推出了类似Y接头(如颈环接头)的接头连接等方法，但建库技术没有从根本上得到改变。此外，该种建库方法中，广泛采用了Y型接头，直到最后的PCR步骤才用带有Index的PCR引物进行不同DNA样品的区分，之后混合进行同一通道(lane)的测序。这种每个DNA样品单独经历整个建库建库流程才能混合测序的方法，极大地增大了操作的复杂性、试剂及人力消耗，不仅建库成本高，而且易于造成不同DNA样品在建库期间的人为偏差(bias)，不利于不同样品间的测序结果的平行比较。

为了克服标准建库流程的上述缺点，一种基于Tn5转座体(transposome)切贴技术的NGS建库方法被开发出来。在该方法中，两个包含引物退火位点的mosaic end(ME)接头首先与高活性的Tn5转座酶组装形成转座体，该转座体能够将DNA片段化并将接头连接至DNA的5′端(该过程被称之为“切贴”(cut and paste)；专有英文术语为“tagmentation”)。最后，DNA片段通过特定的引物进行低循环次数的PCR扩增，产生与高通量测序平台(如Illumina)兼容的文库。然而，当运用该方法进行文库制备时，由于Tn5转座体切贴反应产生的部分DNA片段(理论上达50％)的两端带有相同的接头，因此只有部分DNA片段(理论上为50％)两端带有不同的接头序列，只有这部分DNA片段能够同时被两条不同的引物扩增并测序。尽管抑制PCR能够再DNA片段的DNA扩增过程中在一定程度可增加具有可测序结构的DNA片段的比例，但仍然使文库中的很多DNA片段无法测序，从而丢失大量信息。