[发明专利]一种原发性甲状旁腺功能亢进症状态的小鼠模型构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种模拟原发性甲状旁腺功能亢进症病理生理状态的小鼠模型的建立方法。

背景技术

甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)是甲状旁腺主细胞分泌的肽类激素，主要作用于成骨细胞和肾小管上皮细胞，调控机体的钙磷代谢平衡。病理情况下，甲状旁腺肿瘤或增生分泌过多的PTH入血，引起以高PTH血症、高钙血症为特征的原发性甲状旁腺甲状旁腺功能亢进症(PHPT)。PHPT是第三大常见的内分泌疾病，据报道其患病率在1‰-4‰，因其严重的骨质疏松、肾结石、高钙危象、急性胰腺炎等并发症，严重危害患者的生活质量甚至生存率。

除了骨和肾脏等PTH作用的经典靶器官，近年来的研究观察到PHPT患者还出现了神经认知功能、心血管系统、糖代谢等多个PTH非经典靶器官系统功能的受损，然而这些器官系统受损的原因尚不明确，这些损害的发生与高PTH血症和高钙血症的关系尚不清楚，为了更进一步明确PHPT的病理生理改变及其机制，亟需建立以高PTH血症、高钙血症为特征的模拟PHPT病理生理状态的小鼠模型。

虽然直接给小鼠注射PTH可以引起短暂的高PTH血症和高钙血症，但是外源性合成PTH的半衰期仅有3-4小时，难以模拟PHPT患者长时间的高PTH血症；持续性皮下泵入虽然可以维持高PTH血症，但目前小鼠用泵最长只可维持30天，皮下埋泵需要对小鼠进行麻醉、切开皮肤和缝合，对小鼠伤害大，且注射泵和外源性合成的PTH成本都很高，不便于应用。

目前，文献报道的建立PHPT动物模型的方法主要有两种：甲状旁腺组织特异性过表达cyclin D1癌基因；和甲状旁腺组织特异性敲除MEN1抑癌基因，这两种模型都是通过基因打靶技术改变甲状旁腺组织基因，诱导甲状旁腺组织增生或肿瘤，从而分泌大量PTH入血，而构建PHPT小鼠模型，但这两种构建方法存在以下一些问题:1)组织特异性的基因打靶技术需要的技术要求高，经济成本高，构建周期长；2)甲状旁腺组织特异性Cyclin D1基因过表达的小鼠，要到其出生后6个月-1年，甚至更晚才开始出现血PTH和血钙升高，时间长，且此时小鼠已经进入老年阶段，衰老会影响神经、代谢等多系统功能，不利于小鼠精细表型的观察和研究；3)基因打靶技术难以控制血PTH和血钙升高的程度，难以研究剂量效应关系。

发明内容

本发明要解决现有的PHPT动物模型技术要求高、成本高、周期长、小鼠年龄大、不能控制剂量等问题，提供一种模拟PHPT病理生理状态的小鼠模型的构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明为模拟原发性甲状旁腺功能亢进症病理生理状态小鼠模型，其构建步骤如下：

(1)选择8周龄C57BL/6雄性小鼠，观察饲养一周；

(2)一周后，用体积浓度为75％的酒精进行消毒，消毒部位静脉注射小鼠PTH基因过表达腺相关病毒-9；

所述小鼠PTH基因过表达腺相关病毒-9的每只小鼠的注射量为2.5-7.5×10⁹V.g，该剂量范围既可以保证血PTH升高，又不至于造成血钙过高致小鼠死亡；

所述小鼠PTH基因过表达腺相关病毒-9过表达的基因为甲状旁腺激素，GeneID为NM_020623.2，基因编码序列长度为347bp；

(3)从静脉注射起3周后，即得到模拟原发性甲状旁腺功能亢进症病理生理状态的小鼠模型。

进一步地，所述步骤(2)中，消毒部位为鼠尾。

进一步地，所述步骤(2)中，注射使用的为无菌胰岛素注射器。

进一步地，所述步骤(2)中，所述步骤(2)中，所述小鼠PTH基因过表达腺相关病毒-9的每只小鼠的注射量为2.5-7.5×10⁹V.g。

本发明的有益效果：本方法建立的模拟PHPT病理生理特点的小鼠模型的优势在于：

本模型完全模拟了PHPT患者血PTH、血钙持续性升高的病理生理特点；

模型建立便捷，构建周期短，维持时间长，只需单次尾静脉注射病毒20天后即可模拟高PTH、高血钙、骨质疏松的病理生理特点，且可维持3-6个月，如需延长观察时间，可再次尾静脉注射病毒；

腺相关病毒免疫原性低，且病毒单次注射量低，一次病毒包装(总量在10¹²V.g/ml)可构建1000只左右的小鼠模型，模型成本低；

操作简单，操作死亡率低，成功率高，动物模型稳定性好；

可通过病毒注射的滴度控制血PTH和血钙升高的程度，便于模拟疾病的不同严重状态。

附图说明