[发明专利]植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达人凝血七因子(anti‑hemophilic factor(AHF),FVII，FVIIa,proconvertin)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组FVII成功表达。凝血实验证明生菜生产的FVII具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人FVII的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用。

背景技术

人凝血七因子(FVII，血液凝固因子FVIIa，活化血液凝固因子VII，以前称为替康宁素proconvertin)是一种丝氨酸蛋白水解酶，可以引起凝血级联反应的蛋白质之一。FVII缺乏症(先天性替康康宁缺乏症)是罕见疾病，表现为血友病样出血性疾病，而且是隐性遗传的。先天性FVII缺乏的患者病情是终身的。有这种情况的病人家庭成员，也可能有病情或携带基因。通常，患病人数为30万到50万人中约为1人。也可能比率更高，因为并非所有个体都可能表现出来疾病症状并被诊断出来。

FVII缺乏症中也可以因为某些肝脏疾病，维生素K缺乏症或某些药物(即，柯马丁)从而导致肝脏产生的因子VII量不足。症状可能会有很大差异，一些受影响的个体很少显现或没有症状，而有些个体可能出血过多而危机生命。通常，这种出血病症本身就表现为容易瘀伤，鼻出血，月经过重和延长，牙科或外科手术后出血过多的倾向。新生儿可能在头部，脐部出血或割礼后过度流血。肠道，肌肉或关节或大脑可能会发生其他出血，血尿也可能发生。

目前，人类因子FVII供应量远远落后于需求，导致价格居高不下，导致很多车祸创伤，手术性出血，颅内出血的伤者和脑溢血，血友病患者买不到药或者买不起药。植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达人凝血七因子具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供植物尤其是生菜作为宿主在表达凝血七因子中的应用。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了凝血七因子(FVII)，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组人凝血七因子。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：