[发明专利]检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法

说明书

本发明涉及检测体外细胞增殖用载体及体外细胞增殖动态检测方法。动态检测体外细胞增殖用载体，其特征在于，载体包括：依次连接的PLKO.1序列、CMV序列、eGFP序列、IRES序列和Puro序列。本发明构建的稳转细胞株，与同类细胞株相比，荧光亮度强、光稳定性好、背景信号低，且对细胞的生理无显著性影响。所述检测方法包括：用本发明的载体、psPAX2载体和PMD2.G载体三载体包装慢病毒；用步骤一得到的慢病毒转染目标细胞，嘌呤霉素筛选、流式细胞术分选，得到稳转细胞株；选择合适的细胞数量加入细胞培养板中，待细胞贴壁后，高内涵细胞成像系统采集图像；处理数据，并绘制细胞增殖曲线。本发明自动化程度高，误差小，重复性好，灵敏度高。

技术领域

本发明属于细胞检测技术领域，涉及一种动态检测体外细胞增殖的方法。

背景技术

细胞增殖是生命体的重要特征，是指细胞在周期调控因子的作用下通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等反应进行的分裂过程。生物通过细胞增殖产生新的个体，当细胞增殖失控时，就会导致各种疾病，例如癌症就是由于肿瘤细胞在机体内无序增殖而形成的恶性肿瘤。因此，细胞增殖一直是医学研究的热点之一。细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域，其作为一种实验技术方法，不仅在研究细胞的基本生物学特征中非常重要，而且是分析细胞状态、研究遗传性状和评估应激反应的一种基本方法。

目前检测细胞增殖的常用方法主要包括间接观察DNA合成含量和直接检测细胞代谢活性等两类方法，前者包括3H-胸腺嘧啶核苷(3H-labled thymidine,³H-TdR)掺入法、5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2-deoxyuridine,EdU)标记法、5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU),后者主要为四甲基偶氮唑盐法(3-4,5-diemethylthiazol-2-yl-2,5-dipheuyl tetrazolium bromide,MTT)。

³H-TdR法是将放射性标记的³H-TdR掺入DNA合成期的细胞，用液体闪烁计数仪检测³H的放射活性即可反映细胞增殖能力。该方法有较好的重复性，但是由于使用了放射性的同位素，对实验者和环境有一定的危害而限制了使用；EdU/BrdU标记法是将DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物插入细胞周期S期的DNA分子中，EdU/BrdU与染料的共轭反应可以高效快速地检测细胞增殖，该方法排除了初代细胞的干扰，准确性及灵敏度较高。但是EdU/BrdU的掺入会对DNA产生损伤，从而会抑制细胞的生长，不能全面的反映细胞的增殖。

MTT法的原理是活细胞中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。在一定细胞范围内，甲瓒的量与活细胞数成正比。因此，MTT法有经济、简单、灵敏、无放射性污染等特点，成为目前检测细胞增殖最常用的方法。但是MTT法也存在一些缺点：首先，MTT的测定产物为结晶，因此需要用有毒的有机溶剂如二甲基亚砜溶解，且溶解常常不完全，影响方法的灵敏度；其次，MTT法检测的活细胞中，不仅有新增殖的细胞，也有初始的原代细胞，因此其结果不能去掉原代细胞所带来的干扰；另外，MTT法检测时对细胞造成损伤，只能使用终点法，不能用于后续研究。为克服MTT法的不足，出现了一些改良的检测方法如XTT法、MTS法、CellCounting Kit-8(CCK-8)法等，这些方法和MTT检测条件有所不同，但是都没有很好的解决原代细胞的干扰和对细胞的损伤的两大缺陷。

总之，目前常用的检测细胞增殖技术的主要缺点是：需要标记和破坏细胞，所以无法得到活细胞在生长时的真正状态；采用的是终点法，只能给出最终结果，所以无法对细胞的生长过程作为动态的检测和分析。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种动态检测体外细胞增殖用载体。