[发明专利]猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒的分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)，又称猪丁型冠状病毒，主要是感染猪的整段小肠，引起肠炎并伴有腹泻和呕吐，乳猪发病率和死亡率高达50％-100％。目前，国内外对于猪德尔塔冠状病毒的检测方法主要是ELISA方法、RT-PCR及荧光定量PCR检测方法，由于PDCoV与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)的临床发病情况比较相似，因此增加了PDCoV的检测鉴定难度。在众多的PDCoV检测方法中，由于RT-PCR方法具有较高的敏感性和特异性，因而其成为当今检测PDCoV研究的主要手段之一，但常规的RT-PCR对PDCoV的阳性检出率较低，检测的特异性和灵敏性还不能够满足PDCoV的临床样品诊断，因此，在常规的RT-PCR基础上，建立一种特异性强、灵敏性高，同时PDCoV的阳性检出率提高的检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR试剂盒及检测方法，旨在解决现有猪德尔塔冠状病毒RT-PCR检测时病毒阳性检出率低，检测的特异性和灵敏性还不能够满足猪德尔塔冠状病毒的临床样品诊断的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明的第一个目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含引物和探针；

所述引物的序列为：

上游引物：5'-ACGTCGTAAGACCCAGCATC-3'；

下游引物：5'-CCCACCTGAAAGTTGCTCTC-3'；

所述探针的序列为：

5'-FAM-GTATGGCTGATCCTCGCATCATGGC-BHQ1-3'；

扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段648bp。

优选地，所述引物的浓度为0.75μmol/L，所述探针的浓度为0.2μmol/L。

本发明的第二个目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述检测方法使用上述猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR试剂盒，包括提取病毒的RNA，制备RNA阳性标准品后，按如下TaqMan荧光定量PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测；

所述TaqMan荧光定量PCR反应体系为：在20μL体系中加入以下成份：5×buffer 4μL，dNTP 0.8μL，RRI 0.5μL，GoTaq 0.5μL，质粒标准品2μL，引物(0.75μM)0.6μL，探针(0.2μM)0.4μL，去离子水11.2μL；

所述TaqMan荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性2min，然后95℃变性15s，5 6℃退火延伸1min，变性与退火延伸过程共40个循环。

本发明的有益效果为：本发明根据PDCoV的N基因序列设计并合成了特异性引物和TaqMan探针，建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法能够特异的检测PDCoV，而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及口蹄疫病毒(FMDV)的检测结果均为阴性；用2.66×10⁶、2.66×10⁵和2.66×10⁴copies/μL 3个不同浓度的质粒标准品进重复实验，循环阈值CT的变异系数均低于2％，表明该方法具有良好的特异性；标准曲线斜率为-3.461，相关系数为R²＝0.998，表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品，检测的最低限度为2.66×10¹copies/μL的质粒DNA，表明此方法具有良好的敏感性。利用本发明对194份临床猪粪便样品进行检测，结果显示PDCoV阳性率为22.1％，而利用常规RT-PCR对该临床猪粪便样品进行检测的阳性率仅为11.9％，本发明检测PDCoV的阳性率高出常规RT-PCR检测PDCoV的阳性率近1倍。本发明建立的检测PDCoV的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、批间和批内重复性好，可用于PDCoV临床样品的诊断。

附图说明