[发明专利]一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针，属于分子生物学领域。

背景技术

山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripenumoniae,Mccp)是丝状支原体簇的成员之一，是引起山羊传染性胸膜肺炎(contagious capri pleuropneumonia, CCPP)的病原。该病的发病率和死亡率高 (储岳峰,2009; 赵萍, 2010)，发病率可达100%(Nichlas et al.,2012; Chu et al., 2011)，死亡率高达60%~70%（郑莹莹, 2014）。潜伏期为2~28d，平均10d，其临床特征主要表现为咳嗽、呼吸困难、发热和流鼻涕，病变主要变现为肺肝变、肺脏和胸膜粘连和胸腔积液。CCPP最早可追溯到1873年的阿尔及利亚，1976年由Macowan和Minette在肯尼亚成功分离到病原，命名为F38。现主要流行于非洲、亚洲和地中海沿岸各养羊国家和地区。我国最早可追溯到1958年山东、山西和新疆，随后宁夏、甘肃、贵州等省市均有该病发生的报道(赵萍, 2010,2016; 郭晗,2011)。该病每年给养羊业造成的经济损失较为严重。由于Mccp与Mmc和Mo导致疾病的临床症状及病理变化非常相似，通过临床剖检及病理变化难于区分，因此，该病的诊断依赖于实验室诊断。

当前国内外关于Mccp的诊断方法主要有病原的分离鉴定、病原学检测方法（间接免疫荧光抗体试验（IFAT Rosendal et al.,1972）、胶乳凝集试验（LAT Rurangirwa et al.,1987）和ELISA( Wamwayi et al.,1989 )）、血清学方法(补体结合试验(CFT Houshaymi et al.,2002 )、间接血凝试验(IHAT Muthomi et al.,1983)、胶乳凝集试验（LAT Rurangirwa et al.,1987）和ELISA (Sharew et al.,2005) )和分子生物学检测方法（特异性PCR (Manso-silván et al.,2007) 、PCR-限制性酶切分析法（PCR-REA Bascunana et al.,1994, Bölske et al.,1996)）和SYBR Green Ⅰ 实时荧光PCR方法(Lorenzon et al.,2008 ），但是Mccp对培养基营养要求高，培养非常困难，培养周期长，容易被其他支原体所抑制；而免疫学方法容易和同属支原体发生交叉反应，特异性和敏感性较差，因此，分子生物学方法是CCPP实验室检测的首选方法。但常规PCR灵敏度低、其需要凝胶电泳容易导致产物交叉污染而产生假阳性、且不能定量，这些方法均不能进行CCPP的准确、快速诊断。2008年Lorenzon S等建立了检测Mccp的SYBR Green Ⅰ qPCR方法，其方法特异、重复性好、可以检测80fg/反应的Mccp，灵敏度比常规PCR高2~3个数量级。TaqMan实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR 检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点(万春和等,2010)。但当前国内外尚未有检测山羊支原体山羊肺炎亚种检测的TaqMan实时荧光定量PCR方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的引物和探针。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- GATGCAGTAGGAAGAGAA -3’，

下游引物：5’- GTTCCATCATTTCATTGTTC -3’。

所述探针序列为：5’- CACCAACAACATCATTACCACCACAT-3’。

所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。

利用本发明的引物和探针可用于对山羊支原体山羊肺炎亚种的相应基因进行检测，尤其适用于基于实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量PCR方法。

具体操作方法如下：