[发明专利]一种多重单管RT‑荧光PCR反应缓冲液及其在检测病毒分子中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子检测方法，尤其涉及一种多重单管RT-荧光PCR反应缓冲液及其在检测病毒分子中的应用。

背景技术

在上呼吸道感染病毒的临床检测方法中，分子检测方法具有敏感度强、准确率高和操作简便等优点，近几年来在临床检测和感染性疾病监控中得到越来越广泛的应用。一步法单管多重RT-荧光PCR反应检测上呼吸道感染7种病毒是我公司开发的一项新型分子检测方法。

发明内容

针对病毒RNA逆转录过程和DNA扩增过程的反应效率存在差异，我们通过研究摸索并掌握了一项技术诀窍：采用调节反应缓冲液的pH值和添加PCR反应稳定剂海藻糖来提高一步法多重RT-荧光PCR的反应效率和产物量，大大提高一步法单管多重RT-荧光PCR反应的灵敏度和反应效率。

采用配制不同pH值的缓冲液，应用于RT-PCR反应，通过荧光定量PCR反应结果中的荧光信号值、Ct值、反应曲线图等数据来判断不同pH值缓冲液的反应效率，选择最佳的缓冲液pH值。相比于缓冲液pH值为8.0或pH值为8.8时，缓冲液pH值为9.2时，RT-PCR反应效率的到显著提高，Ct值降低，提高了检测的灵敏度。

在确定缓冲液最佳pH值的基础上，通过添加PCR保护剂海藻糖来提高RT-PCR反应过程的稳定性。对海藻糖的浓度设置不同的梯度，通过荧光定量PCR反应结果中的荧光信号值、Ct值、反应曲线图等数据来判断含不同浓度海藻糖的缓冲液的反应效率，选择海藻糖最佳的浓度。相比于海藻糖浓度为1%、2%、3%、5%时，海藻糖浓度为4%时，RT-PCR能到达较高的反应效率，特别是扩增困难的检测反应得到显著改善。

经过研究，当反应缓冲液的pH值为9.2，海藻糖的浓度为4%时，是本技术的最佳反应条件，达到了高灵敏度，高反应效率的技术目标，满足了临床检测的实际需求。