[发明专利]一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法

说明书

本发明公开了一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法，包括以下步骤：步骤一、将在胶乳溶液中加入蒸馏水进行错流过滤；步骤二、将置换蒸馏水后的胶乳溶液加入到反应釜中，加入氯化锂和十二烷基苯磺酸钠并搅拌混匀；然后通入氩气或氮气去除氧气后，加入过硫酸钾，二次引发微球内部的收敛聚合反应；步骤三、将完成收敛聚合反应后的胶乳溶液加入胶乳试剂标记反应需要的缓冲液进行错流过滤。该方法从胶乳颗粒层面入手，通过相对简单的可放大工艺，直接对胶乳颗粒进行了二次收敛聚合改进，不涉及抗体亲和力改进，不增加原料成本，适用范围广，有效减少了宽线性高抗原过剩项目开发的难度，提高了胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围。

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法。

背景技术

体外诊断领域，胶乳免疫比浊试剂盒中通常将抗体或抗原标记在功能化胶乳微球表面，在一定的缓冲溶液中与被测抗原或抗体反应，形成抗原抗体胶乳微球复合物，带来吸光度信号值变化。使用已知浓度的标准品绘制信号值与浓度的标准曲线，测定未知浓度样品时，由全自动分析仪器根据样品所得信号值与标准曲线比较，计算出被测物浓度。

抗原过剩(安全区)和线性范围是免疫比浊试剂盒最重要的性能指标之一。根据海登博格原理，抗原过剩是免疫比浊试剂实现定量检测的前提和范围，即在抗原过剩范围内才可以定量报告结果，是线性范围的前提。线性范围指被测物含量的测定结果与被测物含量(通常为稀释估算值)成直线比例关系的能力。抗原过剩范围是指高因Hook效应，样本测定结果不低于线性范围上限的最高浓度值。

大多数试剂盒的说明书都会注明，超过线性范围上限的样本需要进行稀释复测，复测结果乘以稀释倍数得到该样本结果。

抗原过剩范围小，则临床上超过抗原过剩范围的病患样本，其测定结果因为Hook效应，低于线性范围不会提示医生需要稀释复检，从而浓度被低估；甚至更严重的出现低于阳性参考值，假阴性的情况，导致误诊和漏诊发生。线性范围上限越高，需要稀释复检的样本少，减少了医院测试成本和人力需求。

诊断项目中，有不少项目需要宽线性范围，同时，抗原过剩要求极高。如重要的炎症标志物C反应蛋白(CRP)，线性范围上限一般要达到320mg/L，抗原过剩范围不低于1000mg/L。肾病标志物微量白蛋白(Malb)，线性范围上限一般要达到400mg/L，甚至1000mg/L，抗原过剩范围不低于50000mg/L。免疫系统指标血液免疫球蛋白G(IgG)，线性范围上限一般要达30g/L，甚至到60g/L，抗原过剩范围不低于400g/L。肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)，线性范围上限一般要求达到250ng/ml，甚至1000ng/ml，抗原过剩范围不低于20万ng/ml(初筛)，甚至治疗监测用的试剂需要不低于100万ng/ml。

本领域技术人员在胶乳免疫比浊中常规提高抗原过剩以及线性范围的方式，为增加抗体使用量或减少样本量。

增加抗体使用量在一定范围内可以提高线性和抗原过剩范围，但在其他条件不变情况下，该方案即提高了试剂成本，又只能在较小幅度使用。同时由于增加抗体量带来的微球表面抗体密度提高，会导致试剂灵敏度提升。在检测系统检测范围有限的情况下，灵敏度和线性范围互相制约，当灵敏度高到一定程度后，就算降低增敏剂用量至零，仍然会因为仪器吸光度检测范围有限，仪器无法区分高浓度样本的信号差异，限制了线性范围和抗原过剩范围。

样本量减少，在仪器技术无重大突破情况下，也是有限度的，而且减少样本量，试剂灵敏度将大幅度降低。

非常规的提高抗原过剩和线性范围的技术包括以下两种：

一是本申请人在申请号为201610227990.1的专利中公开的技术方案，在一些项目中，使用非常严苛的条件，可在可控成本的情况下实现高性能的胶乳免疫比浊试剂。主要是基于仪器预稀释功能，使用特定粒径微球，特定用量的特定抗体，控制样本/抗体比实现的。该方案需要针对不同的项目进行试剂研发，研发周期较长，研发工作量大。