[发明专利]一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法

权利要求书

1.一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)采集外周血液；

b)分离外周血液中的肿瘤血小板、循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞；

c)将分离出的肿瘤血小板、循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞加入胶原蛋白进行三维立体培养；

d)加入待测药物，在细胞培养箱中孵育；

e)采用ATP-TCA或MTT方法对细胞进行形态及生长情况的鉴定，获得肿瘤对抗肿瘤药的药敏信息。

2.根据权利要求1所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，所述c)步骤后，进行一次筛选：选取状态良好的细胞，离心收集，加入胶原蛋白进行三维立体培养。

3.根据权利要求1或2所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，所述b)步骤中，首先采集外周血液中的白膜血，再以白膜血∶Ficoll＝2∶1的比例加入到含有Ficoll的离心管中离心，用巴氏吸管吸出白膜，用PBS稀释混匀洗涤。

4.根据权利要求3所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，白膜用PBS稀释混匀洗涤后，用基础培养液洗涤。

5.根据权利要求1或2所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，所述三维立体培养的条件为：O₂含量为1％～18％，CO₂含量为1％～10％，压力为1～4psi，温度为25～40℃，湿度为30％～95％。

6.根据权利要求5所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，所述三维立体培养的条件为：O₂含量为1％，CO₂含量为5％，压力为2psi，温度为37～37.5℃，湿度为95％。

7.根据权利要求5所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，加入胶原蛋白进行三维立体培养时，细胞悬液的细胞密度为2.5×105细胞/ml。

8.根据权利要求1或2所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，所述d)步骤中，在细胞培养箱中孵育的条件为：CO₂含量为5％，压力为1～4psi，温度为37℃，湿度为95％，培养4天。

9.根据权利要求8所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，所述d)步骤在96孔板上进行，加入不同浓度的多种待测药物及阳性对照药及空白对照孔。

10.根据权利要求9所述的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，其特征在于，所述e)步骤中，在96孔板各细胞孔内分别加入细胞裂解液200μL，室温下混合5min，从96孔板各孔中分别吸取50uL细胞混合溶液加入发光检测板各孔中，依次在各孔中加入50μL荧光素酶试剂混匀，用荧光检测仪检测荧光强度，计算平均值。