[发明专利]一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法

说明书

本发明涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法，属于生物应用技术领域。本发明方法利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境,从而研究卷烟烟气对AQP‑5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了高内涵系统，可高通量检测多个样品对细胞AQP‑5亚细胞定位的影响，可快速准确可视的进行多样品检测；在图像分析步骤时对AQP5的亚细胞定位进行了半定量分析，提高了检测的精度。综上所述，该方法为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。

技术领域

本发明属于生物应用技术领域，具体涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法。

背景技术

唾液是维持口腔微生态环境平衡的主要因素，具有湿润口腔和食物、便于说话吞咽、移走味蕾上的食物微粒，从而不断尝到食物上的味道以及清洁和保护口腔等多种作用。卷烟感官评价表明部分卷烟烟气会引起口腔干涩、燥刺、不适等负面感受，因此研发具有降燥生津功能的卷烟产品，对于改善口腔舒适感提升卷烟抽吸品质具有重要意义。

水通道蛋白家族（Aquaporins, AQP）是特异性跨膜转运水的一组蛋白，能显著增加细胞膜水通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡。AQP5是一种主要表达于唾液腺及皮肤小汗腺的水通道蛋白，主要介导水分子跨细胞膜通透转运，在唾液分泌中起着重要作用。研究表明干燥综合症患者及干燥综合症模型小鼠涎腺细胞中存在AQP5的下调或亚细胞分布异常，因此恢复腺体内AQP5的正常亚细胞分布、上调AQP5成为治疗干燥综合症的可能手段。目前，医学上化学物质对水通道蛋白的影响大多是通过干燥综合症动物模型进行整体动物水平的AQP5研究，不适用于大批量样品的检测。因此如何通过细胞学方法来进行卷烟烟气对水通道蛋白影响检测对生津物质的开发起着重要作用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法，该方法利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP-5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法，包括如下步骤：

步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；

步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2-4×10⁴个/mL细胞浓度接种于含有DMEM/F12细胞培养基的细胞培养板上，在37℃、5%CO₂的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；

步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO₂的条件下对细胞进行培养22-26h；仿生抽吸液体的用量与细胞之间的比例没有限制，按照培养基的常用量使用即可；

步骤（4），培养结束后弃上清，加入4%多聚甲醛室温固定细胞9-11min，再用含有0.2% Triton X-100和1% BSA的PBS溶液使细胞膜通透；4%多聚甲醛的用量没有限制，只要能固定细胞即可；PBS溶液的用量也没有限制，只要能使得细胞膜通透即可；