[发明专利]一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法

权利要求书

1.一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），采用用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；

步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2×10⁴个/mL -4×10⁴个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5%CO₂的条件下培养22-26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2-3d；

步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4-8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO₂的条件下对细胞进行培养22-26h；

步骤（4），培养结束后弃上清，用0.25%胰酶消化细胞后，提取细胞总RNA；

步骤（5），采用步骤（4）得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cDNA；

步骤（6），采用步骤（5）中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBR Green法操作进行荧光定量PCR实验；

PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix 10μL、ddH₂O 6.8μL、上游引物200nmol/L 0.4μL、下游引物200 nmol/L 0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β-actin为内参；

PCR反应条件为，预变性95℃ 5min，变性96℃ 10s，退火／延伸60℃ 30s，共40个循环；

AQP5引物：上游引物为5’-actgggttttctgggtaggg-3’，下游引物为5’-gtggtcagctccatggtctt-3’；

内参引物：上游引物为5’-ggagattactgccctggctccta -3’，下游引物为5’-gactcatcgtactcctgcttgctg-3’；

步骤（7），数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量；

所述的用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置包括用于烟气暴露吸收的瓶体、烟气捕集器和真空泵；所述瓶体的内壁设置模拟人工口腔黏膜内壁并浸润有人工唾液，其下部设置有连通瓶体的烟气进气管，上部设置有连通瓶体的大气连接管及烟气排出管；所述烟气进气管用于卷烟的夹持，且其上设置有第一阀门；所述大气连接管上设置有第二阀门；所述烟气排出管上设置有第三阀门，并通过管道依次连接烟气捕集器和真空泵。

2.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的平衡条件为：温度22±1℃，湿度60±2%，时间48h。

3.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的抽吸采用全自动转盘式吸烟机。

4.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口。

5.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的DMEM/F12细胞培养基的量为5mL。

6.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，培养均在培养板中进行。

7.根据权利要求1所述的卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）消化细胞的时间均为1-2min。