[发明专利]一种胶基型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种胶基型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法。

背景技术

龋病被世界卫生组织(WHO)列为严重危害人类健康的流行性感染性疾病之一，是在细菌等多种因素共同作用下，牙齿硬组织发生的慢性、进行性、破坏性疾病。致龋的因素包括：细菌、食物、宿主和作用时间等。口腔内细菌种类甚多，其中主要是厌氧菌和兼性厌氧菌，包括链球菌属、乳杆菌属和放线菌属等。变形链球菌在口腔中检出率高，接近90％，是主要的致龋菌，它通过黏附、产酸和耐酸等致使牙体硬组织破坏，从而导致龋齿的形成。

胶基型无烟气烟草制品(Tobacco chewing gum)是一种在胶基中加入了一定量的烟草提取物、香料以及其他一些食用添加剂制成的一种口用无烟气烟草制品。胶基型烟草制品的使用方式是放入口中咀嚼，咀嚼的溶出物会与唾液汇合聚集在口腔中，根据消费习惯的不同吐出或者咽下。在产品使用的过程中，产品对人口腔健康的影响是一个重要考察指标。目前的烟草制品仅针对产品本身进行一些物理化学指标的检测，而对人口腔中的微生物影响研究较少，尤其是针对口腔中变形链球菌的研究未曾涉及。因此如何克服现有技术的不足是目前生物检测技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种胶基型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，该方法首先配制含有变形链球菌的人工唾液，并针对胶基型产品的使用特点，采用全仿真模拟咀嚼机来模拟胶基型烟草制品的咀嚼过程，对咀嚼过程中唾液的变形链球菌含量进行荧光定量PCR分析，从而考察在使用胶基型烟草制品前后唾液中的变形链球菌含量的变化，为胶基型烟草制品的口腔健康提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种胶基型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，包括如下步骤：

步骤(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*10^4-1*10⁶CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液，编号为1#液体；

步骤(2)，将胶基型烟草制品放入模拟咀嚼机中，并分多次注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液，进行人工咀嚼，咀嚼过程中，收集不同咀嚼时间点的唾液；

步骤(3)，将步骤(2)收集到的不同咀嚼时间点的唾液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各时间点培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；

步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；

同时，分别以各时间点培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各时间点培养液中变形链球菌含量；

其中，荧光定量PCR反应所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA。

进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法为：

将0.8-1.2g胶基型烟草制品放入全仿真模拟咀嚼机的溶液皿中，注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液10mL，进行人工咀嚼；设置咀嚼机械齿以5秒一次的频率进行上下咬合且左右磨错动作，共20次，咬合宽度为15mm；同时，启动左右开合旋转组件，每隔4次上下咬合且左右磨错动作做一次聚拢翻滚动作，每次聚拢翻滚夹板的旋转角度为45°；完成后收集溶液皿中的液体，编号为2#液体；

第二次再注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液10mL，进行人工咀嚼；设置咀嚼机械齿以10秒一次的频率进行上下咬合且左右磨错动作，共10次，咬合宽度为10mm；同时，启动左右开合旋转组件，每隔5次上下咬合且左右磨错动作做一次聚拢翻滚动作，每次聚拢翻滚夹板的旋转角度为30°；完成后收集溶液皿中的液体，编号为3#液体；

第三次再注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液10mL，进行人工咀嚼；设置咀嚼机械齿以5秒一次的频率进行上下咬合且左右磨错动作，共30次，咬合宽度为8mm；同时，启动左右开合旋转组件，每隔5次上下咬合且左右磨错动作做一次聚拢翻滚动作，每次聚拢翻滚夹板的旋转角度为90°；完成后收集溶液皿中的液体，编号为4#液体。