[发明专利]一种成体人肝源性干细胞系HN及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种成体人肝源性干细胞系，属于医学生物技术领域。

背景技术

肝脏疾病是人类健康的巨大威胁，特别是肝炎病毒导致的肝炎、肝硬化及肝癌在我国尤为严重，随之而来的肝衰竭是最常见的致死病因。原位肝移植被认为是治疗终末期肝病的唯一有效方法，但是由于肝脏来源缺乏等原因,临床应用受到很大的限制。

肝细胞移植是治疗肝脏相关疾病,如急性肝衰竭、遗传代谢性肝病以及病毒等导致的慢性肝衰竭疾病等的一个很好的替代方案。由于肝细胞异体排异问题，肝细胞体外大量扩培养技术以及冻存的肝细胞复苏后存活率较低等难题尚未得到有效的解决，肝细胞移植的应用受到极大限制。因此，寻找一种新的可替代的手段治疗各种肝脏疾病及其导致的肝功能衰竭，成为一种迫切的需求。

肝干细胞(hepatic stem cells,HSCs)是指具有干细胞特点，并能增殖、分化成为肝细胞和胆管细胞的参与肝脏结构和功能重建一类细胞，体外可以大量扩增培养和冷冻并储存于细胞库，移植后肝干细胞在体内可转化为成熟肝细胞以保持肝脏结构和功能正常。肝干细胞根据其起源不同，可分为肝源性HSC和非肝源性HSC。非肝源性肝干细胞起源于肝脏以外组织，需要体外诱导成为有肝细胞功能的细胞，而肝源性干细胞起源于肝脏胆小管树的小胆管和赫令管，在肝脏环境中形成，具有分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞的能力，包括肝卵圆细胞和小肝细胞等。基础研究和临床应用已表明，肝干细胞是替代肝细胞治疗的最好细胞。随着研究的深入和扩展，取得了一些突破性的进展。这为医学上治疗多种疾病打开了一扇崭新的大门，为生命开拓了新的契机。

肝源性干细胞的应用前景：肝源性干细胞具有极其诱人的临床应用价值，主要包括： 1)体外培养肝源性干细胞为细胞移植和生物人工肝提供了一种新的细胞来源；2)其强大的增殖能力及多源性的生物学特点为解决用于移植肝细胞的增殖困难及供体缺乏提供了新思路；3)利用其可向肝细胞转化的潜力启动肝再生，以治疗各种原因所致的急性、亚急性肝坏死，即临床肝衰竭；4)可以作为终末期肝病与肝移植之间的桥梁；5)肝细胞移植或者以肝细胞移植为载体的基因治疗，有可能持续纠正遗传代谢性肝相关疾病患者的代谢紊乱；6)肝源性干细胞对肝癌发生发展有免疫调节作用，我们的研究表明肝源性干细胞明显抑制Hep G2，Hep 3B和Huh7等肝癌细胞株的增殖，具有抗肿瘤作用。7)另外，HN对酒精性脂肪肝具有显著的防治作用。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种特性稳定、成分均一的成体人肝脏干细胞系HN，它能够表达肝脏前体细胞的标志物；并在体外条件下连续传代培养48代且持续表达肝脏前体细胞标志物。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种成体人肝源性干细胞系的制备方法。

本发明要解决的第三个技术问题是提供所述成体人肝源性干细胞系HN在体内外定向诱导肝细胞中的应用，以及在制备生物人工肝中的应用。而且该细胞系还可以用于治疗肝脏遗传代谢性疾病、酒精性脂肪肝和肝纤维化或肝硬化疾病的研究。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的成体人肝源性干细胞系HN经鉴定确定为人肝脏干细胞，定名为HN，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年5月15日，保藏号为CGMCC No.13844。该干细胞系HN在体内外可定向诱导分化为肝细胞、肝胆管上皮细胞为其特征。

所述的成体人肝源性干细胞系HN具有以下生物学特性：

(1)细胞呈典型的上皮细胞形态,连续传代培养48代仍保持该形态特点；

(2)细胞具有较强的增殖能力，但生长存在接触抑制和密度抑制现象，连续传代培养 48代仍保持该增殖和生长特性；

(3)细胞表达肝脏前体细胞标志物：通过RT-PCR方法证实，细胞表达肝脏前体细胞标志物：白蛋白(ALB)、细胞角蛋白19(CK19)、细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白8(CK8)。连续传代培养48代仍表达肝脏前体细胞标志物。

(4)细胞具有多向分化潜能。当细胞处于不同培养环境下，具有向相应细胞分化的潜能；同时无致瘤性。

为解决上述第二个技术问题，本发明提供一种成体人肝源性干细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取肝血管瘤患者切下来的瘤旁正常肝组织；

(2)在无菌条件下行门静脉插管，并进行原位灌流以去除血细胞；

(3)用0.05％胶原酶溶液循环灌注以离散肝组织；