[发明专利]一种双孢蘑菇遗传转化的方法

权利要求书

1.一种双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，其包括：

步骤(a)：将双孢蘑菇液体菌丝接种至米粒培养基中，置于20-25℃条件下进行预培养，培养至米粒表面长出双孢蘑菇菌丝；

预培养期间每天摇匀米粒培养基；

步骤(b)：将长有双孢蘑菇菌丝的米粒与诱导培养基混合，经超声处理和浸泡处理后，弃上清液，取沉淀下的米粒；

步骤(c)：将步骤(b)得到的米粒与含有目的基因的农杆菌侵染液混合，经超声处理和静置侵染后，吸掉多余的农杆菌菌液，置于20～25℃条件下进行共培养；

共培养期间每天摇匀米粒；

步骤(d)：共培养结束后，挑取单颗米粒转入筛选培养基，置于20～25℃条件下进行筛选培养。

2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每100ml计，所述诱导培养基含有：K-buffer 0.8-1.2ml、M-N solution 1.8-2.2ml、1％CaCl₂ 0.08-0.12ml、0.01％FeSO₄ 0.8-1.2ml、20％NH₄NO₃ 0.23-0.27ml、Spore elements 0.48-0.52ml、50％甘油0.8-1.2ml、1mol/L pH5.3 MES 3.8-4.2ml、2mol/L葡萄糖0.48-0.52ml。

3.根据权利要求2所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每100ml计，K-buffer含有：K₂HPO₄ 18-22g、KH₂PO₄ 14-15g；pH 6.8-7.2。

4.根据权利要求2所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每100ml计，M-N solution含有：MgSO₄.7H₂O 2.8-3.2g和NaCl 1.3-1.7g。

5.根据权利要求2所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，Spore elements由500mg/L的ZnSO₄·7H₂O、500mg/L的CuSO₄·5H₂O、500mg/L的H₃BO₃、500mg/L的MnSO₄·H₂O以及500mg/L的NaMoO₄·2H₂O以等体积混合得到。

6.根据权利要求1所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，在步骤(b)中，米粒与诱导培养基的质量体积比(g：ml)为1:1.3-1.7；在步骤(c)中，农杆菌侵染液的用量与步骤(b)中的诱导培养基的用量一致。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，在步骤(b)中，超声处理的频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为1min～2min；浸泡处理的时间为：10～15min。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，在步骤(c)中，超声处理的频率为40～60KHz，功率为140～160W，时间为10s～30s；静置侵染的时间为：20-30min。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，其特征在于，按每L计，所述筛选培养基含有：马铃薯190-210g、葡萄糖18-22g以及琼脂粉18-22g。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的双孢蘑菇遗传转化的方法，步骤(a)中的米粒培养基可通过如下方法制备得到：将米粒清洗干净，用蒸馏水浸泡至米粒微软，散开到纱布上，吸干水分，再装入三角瓶中，高温高压灭菌即得。