[发明专利]突变微囊藻毒素降解蛋白基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种突变微囊藻毒素降解蛋白基因及其应用。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类能诱发肝脏肿瘤的单环七肽化合物，其化学性质稳定，常规水处理技术难以有效去除，而微生物法是去除MCs最安全和有效的方法。国内外在微生物降解MCs方面做了大量研究，但在微生物降解MCs的途径及其分子机理方面则少有深入报道。本研究的目的是通过对1株高效降解MCs的菌株—鞘氨醇单胞菌USTB-05降解微囊藻毒素LR(MC-LR)的特性、降解蛋白信息的获取、降解蛋白的克隆与表达、酶的活性验证及降解产物的分子结构测定，推测鞘氨醇单胞菌USTB-05降解MC-LR的途径与分子机理。

USTB-05菌为革兰氏阴性菌，实验发现在有氧状态下、温度30℃、初始pH值为7.0的条件下对MC-LR的降解能力最强。通过USTB-05菌无细胞提取液降解MC-LR，发现至少有3种酶参与了降解过程。

基因是分子生物学信息携带者，本发明的发明人在先研究(博士学位论文：王华生，鞘氨醇单胞菌USTB-05降解微囊藻毒素LR的途径与分子机理研究，2014年5月28日)表明，通过PCR、反向PCR等生物技术手段，获得了4段降解蛋白USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C和USTB-05-D，并且发现USTB-05-A、USTB-05-B及USTB-05-C分别与mlr基因簇对应的基因同源性很高，推测它们具有相同的降解功能。采用生物技术手段，分别成功克隆了USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C三段降解蛋白，构建了含有MC-LR降解蛋白的重组菌。在IPTG浓度为0.1mM、温度30℃和诱导时间3h条件下，重组菌目的蛋白诱导表达量最大。

然而，如何进一步提高微囊藻毒素降解蛋白的降解能力是发明人一直期待解决的技术问题。

发明内容

本发明针目前降解效率低等问题，利用定点诱变(site-directed mutagenesis)技术，改变编码蛋白质基因中DNA顺序，提供一种突变微囊藻毒素降解蛋白基因，特别是涉及USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C的突变。

在本发明中，突变之后USTB-05-A、USTB-05-B、USTB-05-C蛋白的核苷酸序列分别对应于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。

本发明的有益效果在于，本发明的突变微囊藻毒素降解蛋白基因能够显著的提高鞘氨醇单胞菌降解微囊藻毒素的能力，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：培养及诱导条件：

USTB-05复合培养基组成如下：MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 4.0g/L，NaCl 1.0g/L，CaCl2 20.0mg/L，FeSO4 5.0mg/L，ZnCl2 5.0mg/L，MnCl2·4H2O 5.0mg/L，CuCl2 0.5mg/L，葡萄糖15.0g/L，酵母浸粉1.5g/L。在去离子水中溶解，定容至终体积，pH值调至合适值即为液体培养基。在液体培养基中按1.2～1.5％加入琼脂粉后可制备出对应的固体培养基。配制好的培养基需经过121℃高压蒸汽灭菌20min。

首先分析降解基因USTB-05-A、USTB-05-B和USTB-05-C可能的功能区域，然后分别对功能区域的基因进行定点诱变，所设计的诱变的目标基因序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。对诱变后的基因进行多聚酶链式反应(PCR)扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证无误后，回收目的基因片段，把目的基因片段连接至pGEM-T easy克隆载体，并把连接载体转化至E.coli DH5α。经平板培养后进行蓝白斑筛选，挑取白斑菌落接种于LB培养基(Amp浓度50μg/mL)中培养(37℃、200rpm、18h)，经离心收集菌细胞，提取其中质粒经双酶切验证无误后，取新鲜菌液进行诱变基因的测序。并对诱变基因所表达的酶催化降解MC-RR或MC-LR，进行活性验证。

实施例2：菌株降解MC-LR的活性研究

分别取经测序验证同时含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3序列的菌株和从滇池底泥中筛选的能高效降解MC-LR的Sphingopyxis sp.USTB-05进行试验。