[发明专利]一种用于河川沙塘鳢精子保存的抗冻液及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类精子保存方法，具体涉及一种河川沙塘鳢精子的超低温冷冻保存方法。

背景技术

河川沙塘鳢属于鲈形目、虾虎鱼亚目、塘鳢科、沙塘鳢属。常见于我国长江中下游及其附属水域，具有较高的经济价值。近年来鱼类精子超低温冷冻技术逐渐扩展到鲤科、鲶科和鳟鱼类，为鱼类的人工繁殖做出了很大的贡献，对那些稀有或者濒临灭绝的鱼类物种的保护起到积极的作用。鱼类精子超低温冷冻技术主要分为三种：小丸颗粒冷冻法、安瓿瓶冷冻法和麦细管冷冻法。这三种方法均需要程序控温，对降温过程的控制相当准确。对于野外操作，或者处于衰减状态的精子将不能使用。

在中国专利CN101084927A中公开了一种中华鲟精子超低温冷冻保存技术及工艺，其主要步骤包括鲜精采集、精子稀释、平衡、加抗冻剂、分装、程序降温等步骤。冷却过程需要大型自动化仪器的支持，不方便野外工作和批量生产。

目前有研究对中华乌塘鳢精子进行了超低温冷冻，这是首次对塘鳢科鱼类精子的超低温冷冻研究。但是这种冷冻方法对于河川沙塘鳢的冷冻效果并不理想，冷冻液的作用不佳，解冻后的精子活力不强，存活时间短，甚至凋亡。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术的缺陷提出了一种用于河川沙塘鳢精子保存的抗冻液，将稀释液和抗冻剂混合后再与精子混合，最大限度的较少了由于实验操作对镜子产生的伤害。冷冻液中适宜的盐度和氯化钾浓度可以使河川沙塘鳢精子的活动受到抑制，能够保留精子细胞的自身能量且激活后活力未见显著下降。同时抗冻液使精子细胞少量失水，防止河川沙塘鳢精子在冷冻过程因低温和脱水而失去活性，保证了精子冷冻储存过程中的成活率。

本发明的技术方案为：

一种用于河川沙塘鳢精子保存的抗冻液，包含体积比为包含体积比为1：5-15的抗冻剂、稀释液。例如，抗冻剂、稀释液的体积比为1:5、1：5.5、1：7.5……，优选的，抗冻剂与稀释液的体积比为1:5，进一步优选的，抗冻剂与稀释液的体积比为1:10。

在一个实施方案中，所述稀释液，包含0.34~0.36克NaCl和3.4~3.6克的蔗糖，以水为100 毫升计；

在另一个实施方案中，稀释液包含0.76~0.79克NaCl、0.020~0.022克CaCl2、0.015~0.023克KCl和0.18~0.21克NaHCO3，以水为100 毫升计；

在再一个实施方案中，稀释液包含0.7~0.85克NaCl、0.04 ~0.06克KCl和1.3~1.6克葡萄糖，以水为100 毫升计；

在又一个实施方案中，稀释液包含0.795~0.803克NaCl、0.037~0.042克KCl、0.013~0.015克CaCl2、0.034~0.036克NaHCO3、0.0004~0.008克KH2PO4和0.032~0.036克葡萄糖，以水为100毫升计；

在又一个实施方案中，包含0.79~0.81克NaCl、0.039~0.041克KCl、0.019~0.020克MgSO4•7H2O、0.0070~0.0074克Na2HPO4•12H2O、0.0053~0.0053克KH2PO4、0.034~0.035克NaHCO3和0.095~0.10克葡萄糖，以水为100毫升计。

为了维持稀释液的稳定性，稀释液配置完成后保存于4℃下（例如可以使用冰箱）中待用。

所述抗冻剂为甲醇、乙二醇、二甲基亚砜和甘油中的一种或至少两种。优选为甲醇，例如甲醇与所述稀释液的体积比为1：7.33

一种河川沙塘鳢精子的保存方法，将河川沙塘鳢精子以上述的抗冻液作为冷冻介质进行冷冻保存。冷冻保存之前还包括将河川沙塘鳢精子与抗冻液混合后得到的混合液在4℃下静置5-10min。

河川沙塘鳢精子与抗冻液按1：3-6体积比例混合，优选为1：5。

在冷冻保存之前，对河川沙塘鳢精子的提取的形式不作限定。较好地，可提供一种提取的方法，具体为：取自提前14h注射激素的雄鱼。采精前14 h对雄鱼注射绒毛膜促性腺激素（HCG）和促黄体释放激素（LRH-A2），以促进精子成熟。采集精子时剖开鱼腹腔，取出精巢后快速在干净的培养皿中剪碎，避免接触到水。