[发明专利]一种利用纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗氧化能力测定领域，具体涉及一种基于细胞传感器对多肽的抗氧化活性评价新方法。以结肠腺癌细胞为感应原件，构建细胞凝胶三维网络结构，并结合纳米材料修饰电极，对多肽的抗氧化活性展开评定。

背景技术

自由基是生物体在正常新陈代谢中产生的活性分子，它既是生物体代谢过程中必不可少的信号分子，但过多的自由基又会对生物体的正常生理功能产生影响。有研究表明，生物体的衰老、病变等均与自由基的氧化损伤有关。在正常的代谢环境下，生物体内的自由基可以经抗氧化酶系统及非酶类抗氧化介质代谢清除，从而降低了自由基氧化带来的机体损伤。同时，通过饮食摄入抗氧化类物质如：多酚、黄酮、多肽等均可以起到良好的自由基清除作用，从而减少生物大分子及细胞氧化损伤的发生。近年来，以动物蛋白为原料，通过天然降解或外源酶添加的办法从中提取抗氧化多肽的研究报道屡见不鲜。同时，以体外化学方法检测抗氧化类物质的自由基清除、金属离子螯合及抑制脂质氧化的活性，成为评价抗氧化类物质功能特性的常用手段。化学检测多采用单线态自由基产生及猝灭原理，通过测定自由基反应前后的氧化物质变化进一步反应抗氧化活性的强弱。此方法虽然简易操作，但单一的体外实验并不能完全说明抗氧化物质在细胞及生物体内的作用；而采用动物试验检测抗氧化活性的方法周期过长，不利用实现短时间内的有效评价。因此，为了实现抗氧化多肽的进一步应用，实现抗氧化活性的快速有效及可靠性检测成为目前急需解决的重要课题。

发明内容

本发明针对以上问题，提供了一种纳米材料细胞传感器，并利用该传感器对抗氧化多肽的活性进行评价。该传感器以纳米材料改良电极，以结肠腺癌细胞作为传感介质，以电化学阻抗为指标，实现了抗氧化多肽在细胞层面的抗氧化作用评价，打破了常规化学检测的局限性，进一步扩展了抗氧化类物质的评价方法，为模拟抗氧化类物质的体内生物活性及功能提供了基础。

本发明的技术方案是：

一种纳米材料细胞传感器，包括裸金电极，以及固定在裸金电极上的纳米铂粒子、纳米银线和结肠癌细胞Caco-2。

一种纳米材料细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：

a)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在电压-0.3～-0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；

b)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；

c)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；

d)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO₂含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养5-6天，隔天换液；

e)、细胞固定：将含有Caco-2细胞的DMEM悬浮液与凝胶按照1:1的体积比例混合，轻轻搅拌后吸取4～6μL滴加在纳米修饰电极的表面，接着将细胞电极浸没于CaCl2溶液中进行固定2～4min，制备得到纳米材料细胞传感器。

所述步骤e)中Caco-2细胞细胞以2×10⁶/mL的浓度与凝胶等体积混匀。

一种利用纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法，包括如下步骤：

1)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在电压-0.3～-0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；

2)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；

3)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；