[发明专利]九香虫药用成分分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明提供一种分离纯化技术，具体涉及一种九香虫药用成分分离纯化技术，属于九香虫药用研究领域。

背景技术

九香虫(Aspongopus chinensis Dallas，1851)是昆虫纲半翅目兜蝽科昆虫，又称黑兜虫、瓜黑蝽、屁板虫、蜣螂虫、打屁虫和屁巴虫等。九香虫作为药食两用昆虫最早记载于《本草纲目》，是《中国药典》(20015年版)收载中药，具有理气止痛，温中助阳之功效。国内研究学者认为九香虫具有抗菌、抗凝血、溶解血栓的功效，且对胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等恶性肿瘤细胞具有一定的抑制作用，单用可治疗血管瘤。但是目前对九香虫的有效成分明确鉴定出来的并不多，许多活性成分尚待确定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于：提供一种九香虫药用成分分离纯化方法，为更深入地研究其在肿瘤治疗效果方面的药用价值以及新药的合成与开发奠定基础。同时也有利于贵州省这一宝贵虫药资源的开发利用。

本发明提供一种九香虫药用成分分离纯化方法，该方法具体如下：首先，提取九香虫血淋巴，而后依次通过超滤、Sephadex G-50凝胶过滤层析、FPLC Resource Q离子交换层析、C8柱反相高效液相色谱和C18柱反相高效液相色谱进行分离纯化，最终分离提取九香虫抗肿瘤活性肽。

前述分离提纯方法中，提取九香虫血淋巴的方法如下：取九香虫活虫置于-80℃冰箱冷冻，将冷冻后的九香虫头和翅膀掰掉，其余部分放于10mL的注射器内挤压使其内容物流入离心管中，内容物液体4℃，12000×g离心30min，取水溶性组分再次4℃，12000×g离心30min，取上清液即制得九香虫血淋巴；

前述分离提纯方法中，超滤的具体方法如下：取九香虫血淋巴加适量的水稀释，于4℃，12000rpm离心60min后取上清液，上清液分别使用50kDa和3kDa的超滤管超滤截留分子量为大于50kDa的蛋白质、50kDa-3kDa的蛋白质和小于3kDa的蛋白质及小分子物质,经MTT法检测各组分抑制胃癌细胞增殖效果，其中50kDa-3kDa粗级分离产物为活性组分，进行下一步分离；

前述分离提纯方法中，Sephadex G-50凝胶过滤层析的具体方法如下：取Sephadex G-50凝胶分别经2mol/LNaCl溶液与0.2mol/LNaOH溶液浸泡洗涤后，加入平衡缓冲液Tris-HCl，pH 9.0，煮沸1-2h，冷却至室温后使用抽气泵抽气2h排出凝胶中的气泡，凝胶过滤层析柱保持垂直，使用玻璃棒缓慢搅拌使凝胶载体重悬，沿玻璃棒缓慢倒入层析柱中，使用平衡缓冲液平衡，待柱床体积稳定，将装柱器内多余的溶液吸掉，取经超滤的活性组分通过BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，调整使样品蛋白浓度为45-50mg/mL，使用0.22um滤膜过滤后上样于平衡好的Sephadex G-50凝胶柱，上样量为5mL，上样后用相同的缓冲液进行洗脱，每10min收集一管，使用Ultrospec 2100pro紫外/可见分光光度计检测每管样品的280nm和215nm的吸收值，按峰形图合并样品，冷冻干燥备用，各个峰取少量溶解，使用超滤管超滤脱盐，各脱盐组分经MTT法抗肿瘤活性检测，取活性峰进行下一步分离；

前述分离提纯方法中，FPLC Resource Q离子交换层析的具体方法如下：该步操作在AKTAPurifier FPLC系统中进行，平衡缓冲液：50Mm Tris-HCl，洗脱缓冲液50Mm Tris-HCl+1M NaCl，系统限压0.6MPa，首先使用超纯水清洗上样环及管道并排出气泡，平衡1个柱体积后换为平衡缓冲液继续平衡1个柱体积，UV调零后开始上样，取Sephadex G-50凝胶过滤得到的活性组分用适量超纯水溶解，0.22um滤膜过滤，取适量样品上样于Resource Q柱，使用0-1M NaCl的洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，检测样品的OD₂₁₅及OD₂₈₀的紫外吸收值，按峰收集各组分，各峰冷冻干燥后用少量超纯水溶解，各组分使用3kDa的超滤膜超滤脱盐，经MTT法检测取具有抑制胃癌细胞增殖活性峰进行下一步分离；