[发明专利]一种高支链淀粉生物合成重组基因CBI及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了一种高支链淀粉生物合成重组基因CBI及其应用。

背景技术

淀粉是仅次于纤维素、目前存在最为普遍、价格最为低廉的光能聚合载体之一；淀粉组成单一、易于储藏、用途广泛，是用于建材、纺织、造纸和石油开采的重要工业原料，尤其是其储藏的化学能易于再转化利用，为此，在战略高度重新认识淀粉方兴未艾。

淀粉来自植物种子(如水稻、小麦和玉米等)、块茎(如马铃薯等)等，因食物成分和淀粉特性等原因，马铃薯淀粉是广泛接受和使用的工业原料；我国马铃薯产区淀粉出粉率(生产每公斤淀粉所需块茎量)为1/(7-8),而发达国家为1/(3-4)，生产效率低下，其原因是我国产区淀粉含量仅为15％-18％。

育种是改良或获得品种的基本途径，其依据的原理是孟德尔和摩尔根的遗传原理，杂交是实现性状决定基因重组的基本途径，在欧美马铃薯杂交育种获得了目前80％以上广泛种植的品种，其中，用于淀粉加工目的的品种的淀粉含量均为20％以上。

在西欧，苏格兰农业科学咨询机构官方(爱丁堡)负责维护的欧洲马铃薯品种数据库，库中收集并详细记载了杂交育种获得品种的相关专利；HZPC、Jalving、Averis等是西欧主要的育种公司，其育种创制的马铃薯品种Agria、Desiree、Bintje、Lady Rosetta等被广泛栽培。

由北美联合培育的Russet系列品种广泛应用，由此产生的专利包括Pat.No.5,500,365,Pat.No.5,387,756,Pat.No.5,789,657,Pat.No.5,503,999,Pat.No.5,589,612,Pat.No.5,510,253,Pat.No.5,304,730,Pat.No.5,382,429,Pat.No.5,503,999,Pat.No.5,648,249,Pat.No.5,312,912,Pat.No.5,498,533,Pat.No.5,276,268,Pat.No.4,900,676,Pat.No.5,633,434,Pat.No.4,970,168。

近年，在国际市场对淀粉巨大需求的驱动下，高出粉率、高粘度等高品质淀粉更是炙手可热，过去十多年，国际化工巨头、如荷兰Avbe和德国BASF等纷纷投资于淀粉品质改良的育种研究，在取得了许多育种成果，其中具有代表性的是获得了基因工程改良的马铃薯品种Amflora。

Amflora块茎淀粉中支链淀粉含量在95％以上，由Amflora加工的淀粉，只需传统马铃薯淀粉用量的五分之一，即可达到同样的使用效果；迫于自然主义者的压力，欧盟多年来一直抵制在西欧种植转基因作物，但鉴于Amflora淀粉的巨大诱惑，BASF公司2010获欧盟授权，批准其在欧洲种植Amflora。

淀粉不仅是人类生存所需食物的成分，由淀粉生产的燃料乙醇正在成为动力能源之一，因此，淀粉也是人类活动所需能源的组成部分，鉴于人们对淀粉含有的能量寄予的厚望，未来对淀粉的巨大需求显而易见，大幅增加植物淀粉积累，过去是、今天更是人类面临的重大课题。

淀粉由两类葡萄糖苷聚合物组成,一是葡萄糖alfa-1,4线性连接占绝大部分的直链淀粉,二是在alfa-1,4连接链有多处alfa-1,6分支连接的支链淀粉；直接参与淀粉的生物合成的主要酶有：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase.EC 2.7.7.27))、可溶性淀粉合成酶(SSS)、与淀粉粒结合的淀粉合成酶(GBSS)、淀粉分支酶(BE)、淀粉去分支酶(DBE)。

细菌AGPase是由glgC基因编码的同源四聚体，高等植物的AGPase是异源四聚体(异源四亚基复合体),两个相同的大亚基和两个相同的小亚基，小亚基(SS)行使AGPase的代谢功能，大亚基(LS)主要调控AGPase活性,变构因子诱导的异构调控是AGPase主要的调控形式。

细菌AGPase同源四聚体的单个亚基、植物AGPase异源四聚体的小亚基在其以寡聚体状态存在时，其N端的代谢基团行使ADP-葡萄糖合成的功能，即以磷酸葡萄糖和ATP为底物，合成ADP-葡萄糖，ADP-葡萄糖是alfa-1,4或alfa-1,6糖苷链延伸的底物。

大肠杆菌K12突变菌株618中AGPase亚基G336D突变使其AGPase活力提高33％，在35S启动子驱动下，表达618菌株AGPase编码基因glgC16马铃薯体内，AGPase活力和块茎淀粉含量提高30％以上，表达G336D突变glgC木薯体内，使其AGPase活力提高70％，块根淀粉含量提高2倍以上。