[发明专利]一种PCR扩增方法

说明书

本发明公开了一种PCR扩增方法，该方法为：将DNA模板、引物、聚合酶、dNTP、缓冲液和MgCl₂混合构成PCR体系，进行预变性，变性、退火、延伸三个步骤的循环，延伸，将目的片段进行扩增；其中所述的引物为巯基化修饰的引物。本发明的PCR扩增方法产率高、灵敏度显著增强。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种PCR扩增方法。

背景技术

PCR是一种体外核酸扩增技术，理论上可以在1-2h之内将目标DNA序列从几个拷贝扩增到几百万倍。然而，对有些序列进行扩增时，会出现扩增产率与检测灵敏度较低的现象。于是，很多研究想通过一些方法提高PCR扩增的灵敏度或产率。

中国专利CN 106591287 A、CN105861491 A、CN 105861489 A、CN 105420364 A、CN105420364 A等通过向PCR体系外加己六醇、海藻糖、甜菜碱、乙二醇、山梨醇、石墨烯、聚乙烯亚胺等物质增强PCR的性能。但是，这些物质的作用机理未知，大多仅是推测，往往不同的PCR体系所添加的量都不同，想要达到较好的效果就必须针对每个体系进行添加量的优化，可想而知，即使达到了最终预期的效果也极不便利。

因此，需要开发一种新的PCR扩增方法，提高PCR扩增的产率和灵敏度。

发明内容

本发明提供了一种PCR扩增方法，该方法为：

将DNA模板、引物、聚合酶、dNTP、缓冲液等混合构成PCR体系，进行预变性，变性、退火、延伸三个步骤的循环，延伸等步骤，将目的片段进行扩增；

其中所述的引物为巯基化修饰的引物；

巯基化修饰的引物是在引物合成之后，用巯基己醇与引物5′端的磷酸基团发生酯化反应实现的。巯基化修饰后的引物用HPLC进行纯化，然后冷冻干燥。

引物的合成和巯基化修饰均可以委托基因合成公司完成。

也就是说，除了将引物进行巯基化修饰，其他步骤和常规的PCR体系和扩增步骤一样：

PCR体系可以为10-50μL，包含1x PCR缓冲液、1-2mM MgCl₂、200-400nM巯基化修饰的正反向引物、0.05-0.2mM dNTP、1-2U聚合酶，等。和普通PCR的步骤一样，进行预变性，变性、退火、延伸三个步骤的循环，延伸等步骤，将目的片段进行扩增。其中90-95℃预变性2-10min，变性(90-95℃，15-60s)、退火(45-65℃，15-60s)、延伸(65-75℃，30-120s)三个步骤循环30-40次，最后65-75℃延伸5-10min。PCR扩增结果用0.5％-3％的琼脂糖凝胶进行电泳，最终染色观察PCR产物条带。

本发明的PCR扩增方法具有如下优点：

1、无需额外添加其他成分来增强PCR属性，不涉及添加物量的优化；

2、仅仅通过引物修饰就可以实现PCR扩增灵敏度与扩增产量的提高；

3、本方法具有普适性，无特殊要求。

附图说明

图1引物巯基化修饰提高沙门氏菌基因组DNA PCR扩增的灵敏度

A：引物未巯基化修饰；B：引物巯基化修饰；M：DNA Marker；

1-7：沙门氏菌DNA依次十倍稀释后取2μL作为模板进行扩增，初始浓度为70ng/μL；8：阴性对照

图2引物巯基化修饰提高副溶血弧菌基因组DNA PCR扩增的灵敏度