[发明专利]一种高通量全人源抗体的制备方法及应用

说明书

本发明涉及基因工程及抗体制备，具体公开了一种高通量全人源单克隆抗体的制备方法及应用。所述制备方法包括分离外周血单核细胞，分选浆细胞或抗原特异性记忆B淋巴细胞的单细胞，利用本发明人所提供的引物对单个B细胞抗体的重链和轻链基因可变区进行扩增，利用含重链片段或轻链片段恒定区的线性表达系统载体构建含抗体重链、轻链基因的表达系统，最终实现全人源单克隆抗体的分离纯化。其中，采用本发明所提供的引物组合扩增抗体重链和轻链可变区基因，可保留轻链、重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效价高、全人源、抗体亲和力好、特异性强、无异种血清反应、没有传播其他传染性疾病的危险等优势。

技术领域

本发明涉及基因工程及抗体制备，具体而言，涉及高通量全人源单克隆抗体的制备方法及应用。

背景技术

单克隆抗体(Monoclonal antibodies，MAbs)药物与传统小分子化学药物相比具有更高的靶向性和特异性，是近年来复合增长率最快的一类生物技术药物，已经迅速成为治疗各种传染性疾病，自身免疫病与肿瘤等人类疾病的重要工具。目前生产人源抗体的方法主要有各种抗体噬菌体展示库技术、EBV转化B细胞克隆技术和转基因小鼠技术。抗体噬菌体展示库技术的发展使得体外不经过免疫获得抗体成为可能，但由此所获得的抗体不是原生配对，效率低，未经过人体免疫监视/耐受选择，不是真正意义上的全人源抗体，具有潜在的自身免疫性反应和免疫原性，往往亲和力差；EBV转化B细胞克隆技术生产的全人源抗体，很难产生稳定的细胞系，抗体生产效率低；利用转基因小鼠生产的人源抗体是将人的抗体重链和轻链基因敲人小鼠，通过免疫小鼠后利用传统的小鼠单克隆抗体技术获得克隆抗体。但是，含有将人抗体重链和轻链基因的B细胞/抗体的内产生和成熟的过程是在小鼠体发生的，经过小鼠的免疫监视/耐受选择，因而也不是真正意义上的全人源抗体，具有潜在的自身免疫性反应和免疫原性。

CN102464717A公开了一种人源性抗核抗体的制备方法，其实质为一种噬菌体展示库技术，将所有得到的细胞混合在一起共同分离重链轻链基因，然后随机配对组合，无法确保得到与人体天然抗体完全相同的抗体。

CN101451134A公开了一种从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，其是用磁珠分选的方法获得B细胞，只用了一个细胞标记，没有流式分选仪使用数个细胞标记组合分选得到的细胞精确性好；另外该方法用10个B细胞进行共同基因扩增，将扩增出的几个重链和几个轻链基因随机配对，仍然无法确保得到与人体天然抗体完全相同的抗体。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高通量全人源抗体的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种高通量全人源抗体的制备方法，所述方法包括：

1、分离外周血单核细胞(PBMC)。

传染性疾病自愈患者的血液样本或者经传染性疾病、自身免疫性疾病或者肿瘤患者体内产生的自身抗体的血液样本，分离PBMC。

优选的，选择样本中抗体效价高且浆细胞比例高的时间点采集血液样本。

优选的，利用Ficoll密度梯度离心或HES离心沉淀法或血细胞分离机分离PBMC。

分别针对每种传染性疾病选择市面上已经商品化且已经证明有效的人用疫苗，注射正常人志愿者，并在不同时间点抽血，检测志愿者体内抗体产生情况及浆细胞比例变化情况；另外一种途径也可以与医院进行合作，在与患者签署《知情同意书》的情况下，获取符合条件的正常人或者自身免疫性疾病或肿瘤病人自愈患者或者产生自身抗体患者的全血样本。选择上述样本中抗体效价最高且浆细胞比例最高的时间点，抽取人志愿者血液，利用密度梯度离心的方法分离PBMC。