[发明专利]单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法

权利要求书

1.一种单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，其特征在于：利用DNA四面体构建三维的检测基底，在其上连接的核酸适配体aptamer，识别并捕获PSA；引入连接aptamer的量子点，实现检测信号的测定，包括下述步骤：

（1）DNA四面体与aptamer组装：将DNA 1-5混合均匀，于高盐浓度缓冲液中高温退火形成载带有aptamer的DNA四面体，也称DNA四面体与aptamer组装体；

（2）量子点与aptamer组装：将量子点与生物素修饰的aptamer DNA 6在1×PBS缓冲溶液中混合均匀，于室温孵育；随后混合液离心洗去过量DNA，沉淀物采用PBS缓冲溶液重旋，4℃保存；

（3）载带有aptamer的DNA四面体在玻片上的固定：将DNA四面体与aptamer组装体稀释后，与链霉亲和素修饰的玻片孵育，孵育浓度为10^-10 ~10^-9孵育一定时间后，缓冲液冲洗干净过量组装体；

（4）检测：制备样品池，在样品池中滴加100 μL含有PSA的反应溶液，孵育一定时间后，洗去过量PSA；加入一定浓度的连接有aptamer的量子点，孵育一定时间后，洗去过量的量子点；首先激光激发四面体所带荧光，随后更换激光通路，激发量子点荧光，通过二者共定位确定信号采集位点。

2.根据权利要求1所述的单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，其特征在于，所采用的DNA四面体为不同大小的DNA折纸，边长为18.7 nm。

3.根据权利要求1或2所述的单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，其特征在于，量子点修饰DNA时的缓冲溶为pH=7.4、8 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄、136 mM Na Cl、2.6 mM KCl、1×PBS缓冲液；DNA四面体合成与链霉亲和素修饰的玻片孵育时的缓冲液为pH=8.0、40mM Tris-乙酸、1 mM EDTA、12.5 mM MgCl₂的 1×TAE-Mg²⁺溶液，检测时缓冲液为pH=7.4、100 mM KCl、0.4% w/v葡萄糖、1 mg/mL葡萄糖氧化酶、0.04 mg/mL过氧化氢酶、10 mM 磷酸盐缓冲液溶液。

4.根据权利要求1所述的单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，其特征在于所采用的aptamer为针对PSA的aptamer，为2012年4月8日发表在Biosensors andBioelectronics第36期第1卷第35-40页题为An aptamer based resonance lightscattering assays of prostate specific antigen的论文中第2页2.1 Materials andregents中所记载的序列。

5.根据权利要求1或2所述的单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，其特征在于所采用的DNA四面体与aptamer合成时，DNA 1-5混合比例为1:1:1:1:1；

所采用的DNA四面体与aptamer合成时的退火方式为采用PCR退火，设置程序为95℃反应5 min，4℃保持15 min。

6.根据权利要求1所述的单分子条件下检测前列腺特异抗原的方法，其特征在于采用链霉亲和素修饰的量子点与生物素修饰的DNA 6连接时的量子点浓度为100 nM，量子点与DNA 6连接的比例为1:20，量子点与DNA 6的孵育时间为1 hr。