[发明专利]一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法

权利要求书

1.一种Aβ42修饰蛋白，其特征在于，所述蛋白是在Aβ42的C端的添加6个His后形成的Aβ42-His蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述Aβ42修饰蛋白的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.权利要求1所述Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，包括重组表达载体构建、转化、诱导表达以及纯化，步骤如下：

（1）将Aβ42基因插入到表达载体pET22b的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET22b-Aβ42；

（2）将（1）中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E. coli BL21 (DE3)，获得重组菌株；

（3）对重组菌株进行诱导，表达Aβ42-His蛋白；

（4）诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，使用含有尿素的变性溶液使包涵体变性；

（5）变性后过Ni-NTA树脂，进行亲和层析，采用洗脱液进行洗脱得Aβ42-His蛋白溶液；

（6）采用超纯水作为透析液对步骤（5）所得的Aβ42-His蛋白溶液进行透析；

（7）透析完成后高速离心后去掉上清收集沉淀，采用六氟异丙醇溶液溶解沉淀，均匀溶解后去除溶解不完全的杂质，吸取上清进行冻干处理，即得Aβ42-His蛋白。

4.如权利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，具体如下：

（1）将SEQ ID No.3所示的Aβ42基因与pET22b表达载体连接转化，挑选阳性转化子验证，并提取pET22b-Aβ42质粒；

（2）将测序正确的pET22b-Aβ42表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，获得大肠杆菌工程菌BL21-Aβ42；

（3）采用IPTG对工程菌BL21-Aβ42诱导蛋白表达，37°C诱导4 h，菌液离心收集菌体，获得含有Aβ42-His蛋白的大肠杆菌菌体；

（4）用缓冲液将上述所得菌体重悬，加入终浓度30μg/mL的溶菌酶和1% PMSF，冰浴30min后超声破碎，12000 rpm离心30 min，收集沉淀；

（5）将沉淀用含有尿素的变性溶液完全溶解后，高速离心去除沉淀，将上清经Ni-NTA树脂亲和层析柱，清洗液清洗后，用洗脱液洗脱蛋白得Aβ42-His蛋白溶液；

（6）将上述Aβ42-His蛋白溶液用超纯水透析，通过高速离心，收集沉淀即为Aβ42-His纤维；

（7）将上述Aβ42-His纤维用六氟异丙醇溶解，超声处理使得纤维充分打散，高速离心去除不溶性杂质后，吸取80%上清进行冻干处理，即得Aβ42-His蛋白单体。

5.如权利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，步骤（4）所述变性溶液组成为：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 8 M 尿素, 1 mM DTT。

6.如权利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，步骤（5）所述洗脱液组成为：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 M 尿素, 500 mM 咪唑, 1 mMDTT。

7.权利要求1所述Aβ42-His蛋白在淀粉样蛋白聚集性研究中的应用。