[发明专利]甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于制药领域，涉及甘露糖与壳聚糖硬脂酸嫁接物的化学键合，以及所合成的甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物在肿瘤免疫治疗中的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重地危害人类健康,其发病率和死亡率仍呈不断上升趋势。随着人们对肿瘤与机体免疫功能两者间联系的了解与认识,肿瘤免疫治疗成为继手术、放射治疗和化学治疗之后又一种重要的肿瘤治疗手段。肿瘤免疫治疗目的是激发或调动机体的免疫系统,增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力,从而控制和杀伤肿瘤细胞。与传统的肿瘤治疗方法相比,肿瘤免疫治疗具有可诱导产生持久临床反应、没有典型耐药性等优点,此外,该种治疗方法可提高传统治疗方法的疗效,减轻传统治疗方法的不良反应。

树突状细胞作为最有效的抗原提呈细胞，能够摄取抗原，将抗原呈递给淋巴细胞，进而诱导产生免疫效应。因此，树突状细胞是抗原特异性肿瘤免疫的启动者，成为肿瘤免疫治疗领域的重要靶点。肿瘤免疫治疗中，针对树突状细胞的治疗包括过继性树突状细胞疫苗及各种树突状细胞靶向性疫苗。其中，树突状细胞靶向性疫苗通过树突状细胞表面受体增强抗原递释系统对树突状细胞的亲和力实现靶向。

树突状细胞表面高表达甘露糖受体，用甘露糖修饰抗原递送载体，可增强树突状细胞对抗原递释系统的摄取，以提高树突状细胞的抗原呈递，增强免疫效应。

壳聚糖硬脂酸嫁接物能够在水性介质中自聚集形成胶束。通过壳聚糖上的游离氨基与硬脂酸的羧基化学嫁接，合成的两亲性阳离子嫁接物，可与带负电的生物大分子复合。壳聚糖硬脂酸嫁接物具有毒性低、生物相容性好等优点，对壳聚糖硬脂酸嫁接物进行甘露糖修饰，并与带负电的生物大分子蛋白抗原卵白蛋白及CCR7质粒DNA复合，可增强树突状细胞的靶向摄取，实现高效的基因转染和肿瘤免疫治疗。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物，其具有代表性的结构通式为：

式中n为硬脂酸的化学修饰比例，范围为6.19％～7.87％，m为甘露糖的化学修饰比例，范围为6.03％～8.69％。

本发明的第二个目的是提供甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法：

取22.2mg壳聚糖硬脂酸嫁接物(该嫁接物为国家发明专利ZL200610051601.0所公开)，溶于2ml去离子水，探头超声20次(300-400W工作2s，停止3s)，制备浓度为11.1mg/ml的溶液；称取7.5～15mg D-甘露糖，；称取三乙酰氧基硼氢化钠，溶于去离子水中，水浴超声，制备浓度为10mg/ml的溶液。向壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液加入上述D-甘露糖乙酸溶液(壳聚糖硬脂酸嫁接物与D-甘露糖摩尔比为10:1-20:1)和三乙酰氧基硼氢化钠溶液(壳聚糖硬脂酸嫁接物与三乙酰氧基硼氢化钠质量比为11.1:1)，室温缓慢搅拌(200转/分钟)48小时。将反应液置于透析袋中透析48小时。透析液冷冻干燥，得甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物。

合成路线：

式中n为硬脂酸的化学修饰比例，范围为6.19％～7.87％，m为甘露糖的化学修饰比例,范围为6.03％～8.69％。

本发明的第三个目的是提供甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物在制备肿瘤免疫治疗药中的应用，具体在制备黑色素瘤免疫治疗药中的应用。甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物通过静电吸引与负电性生物大分子蛋白抗原卵白蛋白及CCR7质粒DNA复合形成抗原递释系统，选用C57BL/6，以黑色素瘤为肿瘤模型，左侧腹股沟皮内注射抗原递释系统，考察抗原递释系统对黑色素瘤的免疫疗效。

本发明利用壳聚糖硬脂酸嫁接物上的氨基与甘露糖在酸性条件下形成的醛基发生化学键合，合成甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物，以提高树突状细胞对抗原递释系统的摄取，增加抗原呈递，增强肿瘤免疫治疗疗效。本发明已在细胞水平证明甘露糖的修饰可提高树突状细胞对抗原递送载体的摄取，并在动物水平证明甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物与抗原卵白蛋白及CCR7质粒DNA复合后具有显著的肿瘤免疫疗效。

附图说明

图1为硬脂酸(A)、壳聚糖(B)、壳聚糖硬脂酸嫁接物(C)、甘露糖(D)、甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物(E)的核磁共振氢谱。

图2为甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物、壳聚糖硬脂酸嫁接物、甘露糖+甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物在DC2.4细胞系上的摄取情况。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

(1)甘露糖修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成