[发明专利]一种基于G‑四链体的DNA传感器对Pb2+浓度的测试方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA传感器技术领域，具体涉及一种基于G-四链体的DNA传感器对Pb²⁺浓度的测试方法。

背景技术

在水生生态系统中，铅离子是一种最具毒性的环境污染物之一，它严重威胁着人类的生命健康，因此，开发出具有超高灵敏度、能够定量检测铅离子的传感器具有非常重要的意义。然而，传统的检测方法，如原子吸收光谱（AAS）或电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等，由于仪器本身昂贵、预处理过程繁琐等限制了它在现场和实时的检测之用。研究人员通过不断努力，在铅离子的检测方法上已经取得了巨大进步。其中一些电化学检测法也得到了实际应用，然而其处理过程相对复杂，对操作条件要求较高，因此难以推广使用。

在过去数年间，功能化的核酸成为了一种有力的检测工具并得到了广泛的应用。特别是两种基于铅离子的RNA裂解脱氧核糖核酸酶—8-17E DNAzyme和GR-5 DNAzyme，得到了普遍运用。它们的作用原理都是利用Pb²⁺的辅助作用激发酶的活性催化裂解有核糖核苷酸rA的DNA链，依据得到的荧光信号的变化来进行检测。不过这些检测平台大部分没能在实际中得到应用，因为酶的费用较高，处理过程也相对复杂，最关键的是RNA分子不太稳定。除此之外，Pb²⁺能够诱导G-四链体构象的变化这一现象也被应用到了对Pb²⁺的检测中来。如Dong课题组引入了一个Pb²⁺诱导形成G-四链体的DNA酶作为检测平台，但是他们需要用Hemin和H₂O₂作为辅因子，这可能也限制了它在实际中的应用。又比如，李想等人设计了另外一个方案，他们以氧化石墨烯（GO）作为淬灭剂，通过π-π作用吸附富G碱基的DNA，使修饰在DNA上的荧光基团与GO之间发生FRET作用，将其荧光猝灭，当加入Pb²⁺后诱导G-四链体的形成，使修饰有荧光基团的DNA脱离GO表面而恢复自身的荧光强度。基于这样的原理，他达到了检测Pb²⁺目的，虽然具有较好的检测效果，然而DNA的修饰和GO的制备过程比较复杂而且花费较高，同样不利于实际应用。而Zhang等人利用Pb²⁺诱导形成的G-四链体与荧光基团之间的猝灭作用来对Pb²⁺进行检测，这种方法虽然达到了0.4nM的检测限，但是也没有避开对DNA的荧光标记。

发明内容

本发明是以PS2.M做探针，首次实现了以Pb²⁺诱导G-四链体结构的变化来猝灭G-四链体-PPIX复合物荧光的实验设计，而且只通过“混合-检测”步骤就完成了对Pb²⁺的检测。此检测方法可操作性强，成本低廉、实用，能够满足日常检测要求，同时也具有非常好的灵敏度和选择性。

本发明采用的技术方案是，一种基于G-四链体的DNA传感器对Pb²⁺ 浓度的测试方法，包括以下步骤：

①配制含有探针DNA的混合溶液，有探针DNA的混合溶液包括50mM pH 6.0的Tris-HCl缓冲溶液，50mM KCl，10mM NaCl，0.5μM探针DNA，0~2000nM Pb²⁺；置于95℃的水浴中加热10分钟，之后缓慢冷却至室温；所述探针DNA的序列如SEQ ID NO:1 所示；

②向步骤①处理后不同Pb²⁺浓度下的含有探针DNA的混合溶液中加入等体积0.5μM的PPIX溶液，在暗处反应1h，最后用微量荧光比色皿在荧光光度计中测得其荧光光谱，激发波长设定为410nm，扫描范围为550nm-750nm，测定在632nm处的荧光强度值；PPIX的结构式如下：

；

③绘出不同浓度Pb²⁺下荧光强度值的标准工作曲线；

④将配制的待测Pb²⁺浓度的含有探针DNA的混合溶液置于95℃的水浴中加热10分钟，之后缓慢冷却至室温，加入等体积0.5μM的PPIX溶液，在暗处反应1h，最后用微量荧光比色皿在荧光光度计中测得其荧光光谱，激发波长设定为410nm，扫描范围为550nm-750nm，测定在632nm处的荧光强度值；根据步骤③的标准工作曲线，即可得出待测溶液的Pb²⁺浓度值。