[发明专利]一种鉴别巴林多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种鉴别巴林多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法。

背景技术

巴林多鳞鱚隐存种发现于波斯湾沿岸国家巴林近海，隶属于鲈形目、鲈亚目、鱚科、鱚属。其外部形态与多鳞鱚极为相似：体呈长圆柱形，略侧扁，口小，开于吻端，上下颌骨和犁骨具带状细齿，但口盖骨、腭骨及舌上均无齿。主鳃盖骨小，有一短棘；前鳃盖骨后缘垂直，平滑或略有锯齿，下缘水平。体被小形栉鳞；颊部具鳞2~3列，皆为圆鳞；侧线完全，一条，略弯曲。第一背鳍具XI硬棘，第二背鳍具I硬棘及21~22软条，臀鳍具II硬棘及21~22软条，具69~72侧线鳞；脊椎骨数34。体背部青灰色，头部背侧深色，腹侧白色；体侧侧线下部时有由黑色小点组成的模糊条带。第一及第二背鳍淡黄色，密布黑色小点；腹鳍和臀鳍黄白色，臀鳍带黑点；尾叉浅，近截形；尾鳍深褐色至深灰色。目前还未有用于鉴定该多鳞鱚隐存种的方法，该种的其它研究也未见报道。由于二者形态非常相似，仅凭借形态特征很难将两者区分。因此寻找区分该多鳞鱚隐存种和多鳞鱚的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。

线粒体DNA控制区（又称D-环区，displacement loop region）是线粒体DNA中的一段非编码区，它位于t RNA-Pro和t RNA-Phe之间，是整个mt DNA基因组序列碱基组成和长度变异最大的区域。由于受到选择压力较小，因此积累了较多的突变，如碱基替换、插入、缺失，以及众多的串联重复序列而形成了多态性。因而理论上，线粒体控制区是突变速率最快的序列。被广泛用于群体遗传结构、鱼类遗传多样性的变异分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够准确高效地鉴别泰国多鳞鱚隐存种和多鳞鱚，引物长度适当，与模板的序列紧密互补，鉴别方法简单，易于掌握，准确性高，鉴定结果稳定，可重复性强的鉴别泰国多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记、引物及方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种鉴别巴林多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记，具体标记序列为：

巴林多鳞鱚隐存种的分子标记序列为：

CAGGCATAGTGGGCACAGCCCTAAGCTTACTTATCCGAGCAGAACTCAGCCAACCCGGCGCACTGCTTGGAGACGACCAGATTTACAACGTAATCGTTACGGCACACGCCTTTGTAATGATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTCTGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCTTTAATGATCGGAGCCCCTGATATGGCATTCCCTCGGATGAATAATATGAGCTTCTGGCTCCTTCCGCCCTCTTTCTTA；

多鳞鱚的分子标记序列为：

CAGGTATGGTGGGCACGGCCCTAAGCCTGCTTATCCGAGCAGAACTTAGCCAACCTGGCGCTCTGCTTGGTGACGACCAAATTTACAATGTCATTGTCACCGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCCTTATCGGAGGGTTCGGCAACTGGCTTGTTCCCCTGATGATCGGAGCCCCTGATATGGCATTCCCACGAATGAATAACATGAGCTTCTGACTCCTTCCTCCTTCTTTCCTC。上述巴林多鳞鱚隐存种和多鳞鱚存在38个碱基的差异，表现为32个颠换，6个转换。其结果稳定，可重复性强，能够准确高效低鉴别巴林多鳞鱚隐存种与多鳞鱚。

一种鉴别巴林多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记引物，引物序列为：

L5979：5’-TTTAGTATTCGGAGCCTGAG-3’。

H6233：5’-CCTGAAGAGGCCAAGAGAAG-3’。上述引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，且延伸温度小于74℃，有利于扩增反应的进行。

一种鉴别巴林多鳞鱚隐存种与多鳞鱚的分子标记方法，具体步骤为：