[发明专利]一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因及其制备方法

权利要求书

1.一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据现有的蜘蛛包裹丝的AcSp蛋白基因，在NT端简并引物，在重复区设计2条特异性引物，通过简并PCR扩增得到部分的NT端基因序列；

(2)根据步骤(1)所获得的序列分别设计2对特异性引物及1条锚定引物，通过锚定PCR将NT端补齐；

(3)根据步骤(2)所获得的包含完整NT端序列，在NT端5’末端设计1条正向引物，在CT端3’末端设计1条反向引物，用于扩增全长AcSp基因；

(4)对步骤(3)所得PCR产物进行琼脂糖凝胶切胶回收后，与载体pEASY-Blunt Zero Cloning Vector进行平末端连接反应，之后进行连接产物回收；

(5)对步骤(4)的连接产物进行平末端克隆，使用热击的转化方法，转入DH5α感受态细胞中进行转化，将转化后的菌液涂布在具有Amp和Kan的双抗性的LB固体培养基上，过夜培养后，挑取单克隆进行PCR检测；

(6)将步骤(5)中得到的阳性单克隆的质粒进行完整测序，最终得到大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因。

3.根据权利要求2所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中用于扩增部分NT端的正向引物：TGTTTYCARGCNGTNATG；反向引物：GCACCACTGGTCTGAGAGAAC。

4.根据权利要求2所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的简并PCR的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次。

5.根据权利要求2所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的用于补全NT端的特异性引物1：GACTTGTTGCTTGAAACGATGCTG；用于补全NT端的特异性引物2：GCAGAGAAAGCTCCTTGGTCTTG；锚定引物：ACTCCTGTGGAACCATCGGACGGGGGG。

6.根据权利要求5所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述锚定PCR条件为：在第一轮PCR中，使用特异性引物1进行单引物扩增，条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；之后将PCR产物进行琼脂糖凝胶切胶回收，用TdT酶进行加C反应，产物回收后进行第二轮PCR；使用特异性引物2以及锚定引物进行扩增，条件同上。

7.根据权利要求2所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中用于扩增全长AcSp基因的正向引物：CAGGCTTACAGTCATGAATTGGTTAACC；反向引物：TTAAGCTAAAACTAATTCAAAAGACCTGGCAG。

8.根据权利要求2所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中用于扩增全长AcSp基因的酶为Q5高保真酶；扩增条件为：98℃预变性1min，98℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸10min，循环30次。

9.根据权利要求2所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的平末端连接反应条件为：16℃反应过夜。

10.根据权利要求2所述的一种大腹园蛛包裹丝蛋白全长基因的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:10，复苏时间为1h；LB固体培养基含有氨苄青霉素和卡那霉素，氨苄青霉素和卡那霉素在培养基中的浓度均为100μg/mL。