[发明专利]一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置

说明书

本发明公开一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法，包括步骤：1)激发光和损耗光合束后，调制为线偏振光并调整线偏振方向；2)利用空间光调制器加载的0‑2π涡旋位相板和0‑π位相板同时对激发光和损耗光进行两次调制；损耗光一部分光调制成为横向的空心光斑，另一部分调制成为轴向的空心光斑；3)将激发光偏振调成圆偏光且旋向和涡旋位相板的旋向相反，损耗光偏振态转化为圆偏光且旋向与涡旋位相板的旋向相同；4)利用激发光和损耗光聚焦至样品上，激发光为实心光斑，损耗光为空心光斑，并分别激发和损耗样品发出的信号光；5)收集信号光，得到对应到样品扫描点的显微图像。本发明还公开一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置。

技术领域

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

超分辨荧光显微成像技术在过去十几年里已经取得了显著的进步，并被广泛应用于生命科学等研究领域。超分辨荧光显微镜常被用于获取某个单独样品的高分辨率结构，如单细胞、单个荧光颗粒等，同时也被用于观察不同样品之间的相对空间位置分布和相互作用过程。但与此同时，超分辨率荧光成像在生物医学研究领域的应用中也面临很多实验挑战，因为荧光标记过程和成像光束可能会改变成像样品的结构。

作为第一种突破远场衍射极限的超分辨荧光显微成像技术，受激辐射损耗(STED)显微技术的发展最为迅速，它的实验装置都是基于激光扫描共聚焦显微镜，在原本的实心激发光束的基础上只需再额外添加一束损耗光束。损耗光束在经过一定的相位和偏振调制后会聚焦成一个空心光斑，这个空心光斑通过高光强对荧光分子的刺激逼迫周围被空心光斑激发的荧光分子发生受激辐射而无法产生荧光，而由于中心区域并没有收到损耗光斑的影响，荧光分子正常发生自发辐射产生荧光。由此可见，通过损耗光的损耗效应，可以等效于产生一个横向方向半径远小于正常艾里斑大小的激发光斑，这样就大大提高了其分辨能力。在这样的物理机制下，STED技术的分辨率取决于损耗光斑边缘的损耗效率，也就取决于损耗光束的强度，强度越强，STED技术的等效有效点扩散函数(PSF)越小。有效PSF的半高全宽(FWHM)可以近似表示为：其中I是损耗光强度，Is是对应于将荧光强度损耗掉一半时的损耗光阈值光强。

STED系统所具有的超高分辨能力是大家有目共睹的，但是STED系统在搭建方面的难度也是大家公认的。STED技术需要两路光，两路光在聚焦后需要横向轴向都尽可能完美重合才能有较好的分辨率，同时两路光对光路中像差的校正也有着更高的要求。德国的Hell组提出了共路STED，通过设计一种特殊双折射材料的波片来保证只对STED光进行调制而不对激发光进行调制，从而实现在共路的条件下同时生成亮斑和暗斑，但是这种方法只能实现横向分辨率的提高，对轴向分辨率的提高并没有太大作用，因此导致其横向分辨率(～20-40nm)和轴向分辨率(～900nm)的相当大的差异。当对二维样品进行成像时，这不会产生影响。但是当对沿着光轴延伸的三维生物样品进行成像时，由于过低的轴向分辨率，图像质量将受到严重影响。在提高轴向分辨率方面，已有报道通过结合4Pi技术和STED技术(isoSTED)实现了双色3D超分辨成像，其三维分辨率最高可达到40-45nm。但是isoSTED中的4Pi成像系统比较复杂，光路调节要求非常高，需要使用到双物镜的相干叠加，因此在实用性上非常有限。也有报道在原本涡旋位相板产生横向空心光斑之外，再通过0-pi相位板来产生轴向的空心光斑，从而实现轴向的损耗来提高STED的轴向分辨率，从而满足三维超分辨成像。这种方法虽然比isoSTED系统简单，但是其三维空心光斑的调节是在两路光路实现的，更容易产生额外的像差，成像质量变差，同时两路损耗光也造成成像系统较为复杂，调节难度仍然相对较大。

发明内容

本发明提供了一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置。本装置结构紧凑简单，方便调节；实现了共轴3DSTED，系统简单，像差小，成像质量高；通过一个空间光调制器实现了三维空心光斑调节，节约成本；特别适用于对荧光样品进行三维超分辨成像。