[发明专利]生产新型靛蓝染料谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种构建重组谷氨酸棒杆菌生产新型靛蓝染料的方法，属于生物工程领域。通过将靛蓝合成酶基因(bpsA)及4’‑磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因(sfp)克隆重组，共表达至谷氨酸棒杆菌中，构建重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032‑(BpsA‑SFP)，该重组谷氨酸棒杆菌能以L‑谷氨酰胺为底物合成靛蓝染料。摇瓶发酵培养LBG液体培养基中，温度为30℃，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6‑0.8时，加入0.8mM IPTG及L‑谷氨酰胺11.68g/L，18℃，继续培养48h，靛蓝色素indigoidine产量最高，达到1.75g/L。本发明采用生物工程的策略，构建的重组谷氨酸棒杆菌来合成目的产物靛蓝色素indigoidine，为生物法高产indigoidine提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产靛蓝重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

染料是人类工业生产和生活中必不可少的重要物质之一。我国是世界染料生产大国，常年生产量约占世界70％以上。据国家统计局统计数据显示，2015年我国染料销售额达到830亿元，预计2018年将超过千亿。工业染料大部分都是有机合成，成分中含有硫化氢、碱性物质和酸性物质等。传统染料生产工业产生的高盐废水和废酸是环境污染的重要源头之一。随着我国环境保护力度的加大，染料生产行业也面临着巨大的产业升级与淘汰压力。微生物发酵生产染料相对化学合成生产有着设备简单、条件吻合、污染少等众多优势。所以发展高效的微生物发酵生产染料核心技术是未来染料生产行业发展的出路之一。

目前，食品级的色素大多数以红色、黄色为主，而对于蓝色素，相对稀缺。可作为食品级的蓝色素有栀子蓝色素、藻蓝蛋白和靛蓝，其中靛蓝有天然的和人工合成的，实际应用的主要是人工合成的靛蓝。新型靛蓝染料(indigoidine)是一种来自细菌的天然色素。天然色素具有安全、营养、保健等优点，而人工合成的色素在合成的过程中，容易受到重金属等有毒化学物质的污染，也会对人体造成伤害。消费者对人工合成色素存在疑虑，越来越青睐添加天然色素的食品。因此，通过基因工程、酶工程等手段，改造微生物来生产天然色素得到众多研究者的关注。

Indigoidine是由非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthase,NRPS)催化两分子L-谷氨酰胺缩合而成。目前已经有关于靛蓝合成酶的报道，比如IndC(Erwinia chrysanthemi和Streptomyces aureofaciens CCM 3239)、BpsA(Streptomyceslavendulae)和Sc-IdnC(Streptomyces chromofuscus)。这些靛蓝合成酶的氨基酸序列同源性高，基本构造一致，都含有C(缩合)-A(腺苷酰化)-Ox(氧化)-T(巯基化)-TE(巯基水解)四个结构域。靛蓝合成酶需要一个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)将辅酶A上的4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移到巯基化结构域保守的丝氨酸残基上，使之活化。张等利用靛蓝合成酶Sc-IdnC在大肠杆菌的细胞中表达生产Indigoidine。值得注意的是，大肠杆菌在生产食品等相关物质中受到限制，同时大肠杆菌不是Indigoidine的生物合成原料谷氨酰胺的高效生产菌株，使得Indigoidine后期产量的提高遇到瓶颈。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了以谷氨酰胺为原料开发靛蓝染料的新型生产菌株和方法。通过将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因通过克隆重组，共表达至谷氨酸棒杆菌中，构建重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌能以L-谷氨酰胺为底物合成靛蓝染料。

本发明的第一个目的是提供一种生产靛蓝的重组谷氨酸棒杆菌，其通过共表达靛蓝合成酶及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，进而合成靛蓝染料。

所述共表达，是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体上进行表达。