[发明专利]羊干素及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种羊干素，其特征在于是通过从人胎盘羊膜组织中分离培养羊膜间充质干细胞，用人血小板裂解液培养扩增，再通过收集人羊膜间充质干细胞的培养上清，浓缩后收集制得。

2.根据权利要求1所述的羊干素，其特征在于所述羊干素与药学可接受的辅料制成制剂，优选制剂的剂型为冻干粉。

3.一种权利要求1所述的羊干素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)胎盘羊膜组织中分离培养和扩增人羊膜间充质干细胞：从胎盘剥离羊膜，即刻浸泡于含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的α-MEM基础培养液中，4℃暂时保存，于12小时内进行原代培养；将羊膜取出，经含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的PBS清洗，去除血迹，转移至2-4mlEP管中剪碎，再将多管混合至50ml离心管中，按羊膜组织体积加入10倍体积的内含0.02％EDTA的0.5mg/ml Trypsin，于无菌恒温摇床37℃175-200rpm/min震荡30mins，2000rpm离心5-10mins后弃该消化液，反复2次；再加入内含0.05g/L DNAase的0.5mg/ml CollagenaseⅡ，37℃175-200rpm/min震荡90-120mins，2000rpm离心5-10mins后弃该消化液，以PBS洗重悬后离心沉淀，反复清洗2-3次，再次离心后弃上清，以α-MEM+15％胎牛血清+50μg/ml Vitamin C+2mM L-glutamine完全培养液，37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天收集未贴壁组织及培养液，以2000rpm离心10mins后，以上述完培重新接种培养，显微镜观察，原代细胞经内含0.02％EDTA的0.05mg/ml Trypsin消化传代至第2代进行质量检测，随后利用含5％人血小板裂解物培养人羊膜间充质干细胞进行扩增培养，上述操作均为无菌条件下；

(2)人羊膜间充质干细胞质量检测：

1)病原微生物及生化检测

取步骤(1)中第3代人羊膜间充质干细胞，①通过直接接种法检测需氧菌、厌氧菌；②ELISA法检测HbsAg、HbcAb、HcvAb、抗-HIV(I+II)、CMV-IgM、梅毒抗体、EBV抗体；PCR法检测HTLV-I/II、支原体；③速率法检测ALT；④鲎试剂法检测内毒素；检测确定细胞无病原微生物感染和毒素；

2)人羊膜间充质干细胞干性维持的主要技术与性能指标检测

利用流式细胞术检测CD29、CD44、CD73、CD105、SSEA4、CD14、HLA-DR、CD79b、CD34、CD45免疫表型相关分子表达，鉴定经培养扩增后的人羊膜间充质干细胞维持间充质干细胞的免疫表型，利用实时荧光定量RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2、CXCR4表达水平，鉴定经培养扩增后的人羊膜间充质干细胞特性不变；

(3)羊干素制备：培养步骤(2)中检测合格的第三代细胞铺满至90％以上，将α-MEM+5％HPL+50μg/ml Vitamin C+2mM L-glutamine完全培养液倾倒后，依次使用PBS、α-MEM基础培养液清洗2-3次，每次每皿加10ml，然后每皿加6ml α-MEM基础培养液，培养24-48小时后，收集上清，经0.22μm滤器过滤后，加至Amicon Ultra-15超滤管中，4000rpm离心30min-45min，浓缩至原容积1/2，收集、混匀、分装。

4.一种权利要求2所述的羊干素冻干粉，其特征在于是通过将羊干素加入右旋糖酐40和生物活性海藻糖溶解过滤后冻干制得。

5.一种权利要求4所述的羊干素冻干粉的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

按1:1:15的质量比例分别将右旋糖酐40和生物活性海藻糖溶于羊干素，经0.22μm滤器过滤后，分装密封冻存于-75～-85℃，待完全冻成固体后取出，稍微开启容器塞至液体与外界相通即可，上冻干机冻干，至冻干成白色粉状。

6.根据权利要求5所述的羊干素冻干粉的制备方法，其特征在于所述冻干包括以下步骤：在将冻干箱进行空箱降温至-25℃以下后，将容器放入冻干箱内；抽真空之前提前使冷阱工作，抽真空时冷阱温度不高于-40℃；待真空度达到13Pa～26Pa，继续抽真空1～2h以上；进行升华干燥24～48h；升华干燥结束后，拧开进气阀进气，打开冻干箱，然后进行加塞封口，以防重新吸收空气中的水分。