[发明专利]一种头孢菌素C酰化酶突变体及其制备和应用

权利要求书

1.一种头孢菌素C酰化酶突变体，其特征在于，能够催化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸，所述头孢菌素C酰化酶突变体与野生型头孢菌素C酰化酶相比表现出更高的催化活性，酶活提高约6.4倍；所述头孢菌素C酰化酶突变体的序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的一种头孢菌素C酰化酶突变体，其特征在于，序列为SEQ IDNO.1的头孢菌素C酰化酶突变体比野生型头孢菌素C酰化酶具有更高的底物催化活性。

3.根据权利要求1所述的一种头孢菌素C酰化酶突变体，其特征在于，酶活的检测包括如下步骤：

步骤11：将酶活性定义为每分钟水解 1μmolCPC-Na的酶活为一个单位U，检测酶活采用氢氧化钠滴定法；

步骤12：配制pH8.0的磷酸盐缓冲液；

步骤13：配制CPC-Na盐溶液；

步骤14：将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的2%CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中，加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠滴定液滴定，保持反应溶液pH为8.0，同时记录反应约6~8min内氢氧化钠滴定液消耗的毫升数；

步骤15：酶活计算；

步骤16：HPLC分析。

4.一种多核苷酸，其特征在于，多核苷酸编码是由序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体重组的多肽。

5.根据权利要求4所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列为SEQ IDNO.2。

6.一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，通过序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体生产7-氨基头孢烷酸。

7.根据权利要求6所述的一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，其生产方法步骤如下：

步骤21：配制pH8.0的磷酸盐缓冲液；

步骤22：配制CPC-Na盐溶液；

步骤23：将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的10%CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中；

在加酶液前取样500μl，立即加入500μl终止液；

混匀后12000g高速离心10min后取上清进行保存；

加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH，保持反应溶液pH为8.0；

步骤24：分别于加入酶液后 100min、200min、250min、300min取样500μl，加入500μl终止液，混匀后12000g高速离心10min后，取上清进行HPLC检测。

8.根据权利要求6所述的一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，所述头孢菌素C酰化酶突变体重组表达蛋白的生产步骤如下：

步骤31：挑取含有SEQ ID NO.2序列的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的培养基中，30℃、250rpm过夜培养；

步骤32：次日取1L三角瓶，按1:100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中，于30℃中培养至菌体OD5-6；

步骤33：立刻将三角瓶置于25℃摇床中、250rpm培养1小时；

步骤34：加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃、250rpm继续培养16小时；

步骤35：培养结束后，将培养基于4℃、12000g下离心20min收集湿菌体；

步骤36：将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；

步骤37：取少量菌体进行SDS-PAGE检测。

9.根据权利要求8所述的一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，所述步骤32中，每升所述培养基中包括以下成分：

胰蛋白胨：10g；

酵母提取物：5g；

磷酸氢二钠：3.55g；

磷酸二氢钾：3.4g；

氯化铵：2.68g；

硫酸钠：0.71g；

七水硫酸镁：0.493g；

六水氯化铁：0.027g；

甘油：5g；

葡萄糖：0.8g；

卡那霉素：50mg。