[发明专利]一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法

权利要求书

1.一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，其特征在于：通过直接敲除枯草芽孢杆菌合成γ-PGA的基因——pgs，同时敲除抗性标记，阻碍芽孢杆菌合成γ-PGA，进而降低发酵液的粘度，促进菌体生长，提高发酵产物浓度；

其中直接敲除过程为：通过酶切，将pgs-F插入到pBTS质粒的KpnI和BamHI之间，将pgs-R插入到BamHI和XhoI之间，敲除pgs基因，构建新的质粒pBTS-pgs；

所述pgs-F和pgs-R通过引物扩增，引物序列为：

pgs-F-F gaggtaccAGCTGTTCCGATTTTATACTGGTC；

pgs-F-R gaggatccGTTTGTTGCCGTAGCCATCGTG；

pgs-R-F gaggatccCTAATCGACTAAGCCAAACTTCTC；

pgs-R-R gactcgagTAGCCAAAACAGCTCCTCCTTG。

2.根据权利要求1所述的一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)抽提待改造菌株的DNA，通过引物扩增pgs基因的上游片段pgs-F和下游片段pgs-R；

(2)通过酶切，将pgs-F插入到pBTS质粒的KpnI和BamHI之间，将pgs-R插入到BamHI和XhoI之间，敲除pgs基因，构建新的质粒pBTS-pgs；

(3)通过电转化将pBTS-pgs转入待改造菌中，得阳性转化菌株；

(4)挑取(3)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间24h；

(5)取步骤(4)中菌液100ul—500ul，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB平板上，培养温度为45℃，进行过夜培养；

(6)挑取步骤(5)中的菌落进入液体培养基中进行培养，每8—16h传代一次，直到筛选到无抗菌株；

(7)取步骤(6)中的菌液进行稀释涂板，稀释10⁵-10⁶倍，过夜培养；

(8)挑取步骤(7)中的菌落进行抗性鉴定，直到获得5-10株无抗菌株；

(9)将无抗菌株接种到液体培养基中，过夜培养，抽提细菌基因组，进行PCR鉴定；阳性菌株继续进行测序鉴定，测序鉴定结果为阳性菌株即得敲除pgs基因的芽孢杆菌菌株。

3.根据权利要求2所述的一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，其特征在于：所述步骤(2)中敲除pgs基因，同时敲除抗性标记。

4.根据权利要求2所述的一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，其特征在于：所述步骤(1)和(3)中待改造芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、Z12菌株。