[发明专利]一种N‑中端骨钙素化学发光检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，具体是一种N-中端骨钙素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

骨钙素是骨基质中最重要的一种特异性非胶原蛋白，由骨和牙齿中的成骨细胞合成并分泌，其与骨钙的结合作用依赖于维生素K。骨钙素分子含49个氨基酸，分子量约为5800D。在骨合成中，成骨细胞产生骨钙素，此过程依赖于维生素K，同时维生素D3有促进产生骨钙素的作用。使用维生素K拮抗剂，可使此蛋白在骨中的含量减少，但并不影响其脯氨酸的含量，也不影响骨的机械强度。骨钙素产生后一部分进入骨基质，另一部分释放进入外周血。因此，血清（血浆）中骨钙素的含量与各种骨代谢紊乱中骨转化率有关。

完整的骨钙素包含49个氨基酸，1-43氨基酸的片段为N-中端骨钙素（N-MID）。完整的骨钙素在外周血中不稳定，羧基端的43-44间的氨基酸易被蛋白酶水解，裂解下来的N-MID则稳定的多。因此，测定血清（血浆）中的稳定N-MID，从而确保检测结果的稳定性。

目前，检测N-中端骨钙素的方法有放射免疫技术、胶乳增强比浊法、酶联免疫技术、化学发光免疫技术等。其中，放射免疫技术，放射免疫测定法虽然具有高灵敏度、高特异性的优点，但其操作步骤较多，需要特殊的检测设备，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染，使操作人员受到放射性危害；另外，放射性同位素易衰减，有效期短，不易保存。酶联免疫方法，采用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记物，其酶标记物易失活，显色底物见光易分解，灵敏度低，操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要，且其对结构类似的化合物具有一定的交叉反应，造成测试结果不准确。胶乳增强免疫比浊法虽然具有操作简单、快速的优点，但是灵敏度低、低值重复性差。

CN 106353106 A（2017.01）公开了一种化学发光检测骨钙素试剂盒，该试剂盒采用碱性磷酸酶标记骨钙素单克隆抗体，采用碱性磷酸酶的缺点主要是酶促受环境影响大：如消毒液、酸碱度、离子都会对其造成影响，影响测定结果，且底物达到平台期的时间长，底物成本高，导致检测成本高。而本公司开发的一种N-中端骨钙素化学发光试剂盒，采用吖啶酯作为标记物，具有检测稳定、测量快速、灵敏度高的优点。

化学发光方法较其他方法的优点在于检测的简单性。

该体系采用磁分离体系，吖啶酯标记的化学发光技术进行检测，其具有的优点是：吖啶酯作为发光剂不需催化剂的存在，在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光；吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，可提高系统整体灵敏度，反应迅速；背景低、信噪比高，是一类有效的化学发光标记物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的N-中端骨钙素的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种N-中端骨钙素的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测N-中端骨钙素的试剂盒，采用磁微粒偶联N-中端骨钙素捕获抗体，吖啶酯标记N-中端骨钙素检测抗体。试剂盒还包括N-中端骨钙素校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。

本发明所述磁珠的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，所述磁珠的表面修饰基团为羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。

本发明中的磁颗粒偶联悬浮液由N-中端骨钙素捕获抗体偶联的磁颗粒和试剂缓冲液组成，其中N-中端骨钙素捕获抗体的浓度为0.1-2.0 mg/mL。

本发明中的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

本发明中的吖啶酯标记物是吖啶酯标记N-中端骨钙素检测抗体溶液，其中吖啶酯溶液的浓度范围为2-85 mmol/L。

本发明中与磁颗粒偶联的N-中端骨钙素捕获抗体和吖啶酯标记的N-中端骨钙素检测抗体均为单克隆抗体。

本发明中偶联缓冲液是pH 5.0-6.0，浓度为20-200 mmol/L的MES缓冲液。

本发明中在制备磁微粒混悬液时，所述封闭缓冲液为含1-5% BSA的缓冲液。

本发明中所述的N-中端骨钙素系列校准品浓度分别为：0 ng/mL、0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL，其缓冲液是含有0.5-5.0 % BSA的Tris或PBS或HEPES。